耐久肠球菌(坚韧链球菌)/耐久肠球菌(坚韧链球菌)/AS1

 耐久肠球菌(坚韧链球菌)/耐久肠球菌(坚韧链球菌)/AS1.2284=ATCC19432 =DSM20633 =NCTC8307 =JCM8725 菌种及培养条件的选择
    菌种的选择对冻干的效果也是很重要的，乳酸菌因种属的不同其抗冻能力也互不相同。如链球菌属抗冻能力较强，明串珠菌和乳杆菌则稍差一些。细菌在稍低于最适生长温度中培养，收集的细胞耐冻能力较强；或通过优化生长培养基提高细胞浓度，来降低细胞在冷冻干燥条件造成的损伤。此外，菌体收集时期对冻干影响也有不同，对数期细胞对温度较为敏感，而对数期末期和稳定期前期收集的细胞抗冻能力较强，可能是由于细胞膜结构的稳定性与细胞生长阶段有关(Brashears等，1995)。
    在一些研究中发现在生长培养基中加入一些金属离子有利于冻干。Abraham等(1990)研究发现在生长培养基中加入适量CaCO3可以有效防止细胞在冻干时造成的死亡及损伤，Mn2+、Mg2+却没有这种作用。
    冻干前的预处理
    冷休克和热休克
    由于温度的突然降低，微生物经受一系列物理和生化变化，包括一系列蛋白的合成，即冷休克蛋白，冷休克蛋白存在于低温条件下，结果耐冷能力增强，同时细胞膜里的不饱和脂肪酸增加，这种现象可以看成微生物在低温条件下保护自己的一种机制（辛明秀，1998；Bae等，1997；Derzelle等，2000）。

    Jeroen等人比较20℃，4h和10℃，4h处理嗜热链球菌，发现在20℃，4h产生的冷休克蛋白（CSPs）的数量是10℃，4h产生蛋白数量的2～3倍，其冻干后存活率明显高于后者（Kim等，1998）。Broadbent（1999）等对乳酸乳球菌进行了冷休克（10℃，2h）处理，发现细胞内出现冷休克蛋白Caps，同时细胞膜脂成分发生变化不饱和脂肪酸含量增加，不饱和脂肪酸某种程度的增加，会引起脂类溶化点的降低，致使饱和膜脂肪酸/不饱和脂肪酸比值降低，增加了抗冻能力。Kim等也证实了对乳酸乳球菌冷休克处理（10℃、5h）与未经过冷休克处理的菌株相比，冻干后可明显提高存活率，所以通过对细胞采用适合的休克处理，可改善细胞的抗冷冻干燥能力。但是随着冻干后长时间的贮存，冷休克蛋白的作用则明显减少（Wouters等，1999）。
Prasad等(2003)对Lactobacillus rhamnosusHN001进行50℃热休克处理后，在30℃条件下保藏，其存活率明显（p<0.05）高于未热休克处理的对照样。Broadbent等对乳酸乳球菌进行了热休克处理（42℃、25min），经过电泳试验发现产生热休克蛋白Hsps，并且产生与未处理菌株细胞膜相比有较高的脂肪酸(C19：0)含量，冻干后发现对细胞的存活率有较大的提高，因此热休克处理也是提高冻干后存活率的一种方法(Broadbent 等，1999)。关于冷休克蛋白和冷休克反应机制还不清楚，需要进一步证实，但不可否认冷休克与热休克一样都是微生物为了生存而对环境的一种适应。
摘要： 基因克隆菌种的保藏一般采用冷冻保藏的方法.一般是将菌种于-20℃或-80℃以下的温度保藏,通过冷冻,使菌体代谢活动停止.在保藏的时候,通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂（如甘油）.
  耐久肠球菌(坚韧链球菌)/耐久肠球菌(坚韧链球菌)/AS1.2284=ATCC19432 =DSM20633 =NCTC8307 =JCM8725基因克隆菌种保藏

1、实验简介

基因克隆 菌种 的保藏一般采用冷冻保藏的方法.一般是将菌种于-20℃或-80℃以下的温度保藏,通过冷冻,使菌体 代谢 活动停止.在保藏的时候,通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂（如甘油）.

实验中使用的主要仪器：

超净工作台 -20℃柜式冰箱 -80℃超低温冰箱

2、实验前准备

超净工作台照射紫外灭菌30分钟后,点燃里面的酒精灯,用酒精棉球擦拭台面,保证严格无菌操作.

3、菌种保存

过夜培养的 大肠杆菌 都要先进行菌种保存已被后用.取数个1.5ml 灭菌的EP管,做好标记,先加入灭过菌的甘油,再加入菌液混匀,最终制备成15%甘油菌；为了避免外来菌种的污染,一般最后要用封口膜对EP管封闭.
微生物 具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

　　低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

　　保藏方法大致可分为以下几种：

1．传代培养 保藏法

　　又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌 用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法

　　是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法

　　是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4．寄主保藏法

　　用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5．冷冻保藏法

　　可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法

　　先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

　　有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

　　 耐久肠球菌(坚韧链球菌)/耐久肠球菌(坚韧链球菌)/AS1.2284=ATCC19432 =DSM20633 =NCTC8307 =JCM8725三、器材

　　细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；

　　肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

　　灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。