- ￥1500
- EK-Bioscience
- MY9033
- 2025年07月15日
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2ug
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*发表【英文论文】请标注：From Shanghai EK-Bioscience Biotechnology Co., Ltd.
用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR11提供了SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。2、PCR重组克隆 重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONR载体（包含attP位点
是线性的，如果用质粒必须做酶切，但是事实证明用超螺旋的质粒结果没有区别。5. 同理，用引物在目的基因上下游加入AttL序列后直接进行LR反应也是可行的，可以省去BP反应相关的材料和费用。但是pDONR系列载体自有其优点（载体小，拷贝数高，卡那霉素抗性，容易测序），所以要按实际情况权衡6. 慢病毒载体的空白质粒有大量的重复序列，久存会导致LR反应成功但是转化后抽不出质粒的情况，需要注意。
3. 用SuperScript™ II逆转录酶合成第一链和第二链cDNA 4. 连接attB1接头 5. 加上接头的cDNA和pDONR™222载体混合在BP Clonase™酶存在时构建入门文库 6. 得到的入门克隆有attL位点；产生的副产物是自由的ccdB基因 7. 转化E.coli并选择抗卡那霉素的克隆
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