NDETM3000转染试剂

NDETM3000转染试剂

 

产品介绍：

NDETM3000转染试剂是威斯腾生物研发的一款新型阳离子聚合物（非脂质体）转染试剂。NDETM3000带有更高的正电荷，能够高效压缩DNA/RNA，将DNA/RNA包裹在聚合物的内部，通过细胞自身的胞吞作用，进入细胞内吞体中，然后通过吸收内吞体中的H+，改变其PH值，使内吞体解体，将DNA/RNA释放到细胞质中，实现DNA/RNA的高效转染。

 

产品特点：

NDETM3000转染试剂具有以下特点：

——转染效率高

——温和低毒

——性价比高

——易于针对广泛的细胞类型进行优化

目前已验证NDETM3000可以高效转染(>80%)的哺乳动物细胞系有：HEK293、HeLa、CHO、COS；昆虫细胞系有：Sf9和Sf21；对其他细胞系也有一定的转染效率，包括某些原代细胞系，在优化的条件下可实现40-60%的转染效率。

此外，可以使用NDETM3000进行腺病毒、慢病毒和腺相关病毒高效包装，其中慢病毒初始液滴度最高可达107TU/ml，经超离或超滤浓缩后，最终滴度可达109TU/ml（病毒包装优化步骤可以登陆威斯腾生物官方网站查询下载）。

 

贴壁细胞转染步骤：

以6孔板培养体系为例，进行哺乳动物细胞系转染。其他培养体系，参考表1调整。

1.转染前一天，将细胞接种6孔板，使转染时细胞汇合率达60—80%；

注意：细胞状态对任何转染试剂的转染效率都有着至关重要的影响，在转染前，应该观察细胞状态是否良好；对于刚复苏的细胞，建议传三代后再进行后续转染实验，以保证细胞处于旺盛生长期。

2.转染前1-2h，更换2ml新鲜DMEM+5%FBS培养基；

注意：对于293系列易转染的细胞系可以不换液；而要得到很好的转染效果，建议使用2%-5%的血清可以得到更高的转染效率。

3.向1.5ml无菌EP管中加入100μl Opti-MEM（或者其他无血清培养基），随后吸取2μg质粒转移至Opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟；

注意：Opti-MEM和质粒从冰箱取出后，先让其恢复至室温，然后再进行转染操作；质粒在转染前请混合均匀。

4.取3～4μl NDE3000转移至Opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置15分钟；

注意：NDE3000从冰箱取出后，先让其恢复至室温，然后再进行转染操作；在转染前请混合均匀。

5.静置完毕，用枪头轻轻来回吸打上一步混合液3次后，再转移混合液至细胞培养基中，轻轻摇匀，将细胞放回37°C培养箱中继续培养；

注意：来回吸打混合液可以更充分地分散NDE3000与质粒DNA形成的复合物。

6.16-20h后，更换新鲜的完全培养基，继续培养24-72h后检测基因表达。

注意：转染24小时可以检测到目的基因表达，但RNA和蛋白最高丰度表达分别出现在48小时和72小时。

Table .1 不同培养皿NDE^TM3000转染试剂用量

培养皿规格	表面积（cm2）	接种细胞数(个)	培养基量（ml）	稀释液体积(μl)	DNA的量（μg）	NDE3000的量(μl)
96孔板	0.3	1.2-2.4X104	0.1	10	0.1-0.2	以质粒ug数乘以1.5-2 ul，例如2μg质粒，需要3-4ul NDE3000
48孔板	1.0	4-8X104	0.2	20	0.2-0.4
24孔板	1.9	0.8-1.6X105	0.5	50	0.5-1.0
12孔板	3.5	1.5-3X105	1	50	1-2
6孔板/35mm	9.6	4-8X105	2	100	2-4
60mm	21	0.9-1.8X106	4	200	6-12
100mm	58	2.2-4.4X106	10	500	12-24
T75	75	3-6X106	15	1500	18-36

 

悬浮细胞转染步骤：

以250ml Shake flask（振荡培养瓶）培养体系为例：

1.转染前2小时，接种5.0*107细胞至250ml Shake flask；

注意：细胞状态对任何转染试剂的转染效率都有着至关重要的影响，在转染前，应该观察细胞状态是否良好；对于刚复苏的细胞，建议传三代后再进行后续转染实验，以保证细胞处于旺盛生长期。

2.向15ml 离心管中加入2.5ml Opti-MEM（或者其他无血清培养基），随后吸取50μg质粒转移至Opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟；

注意：Opti-MEM和质粒从冰箱取出后，先让其恢复至室温，然后再进行转染操作；质粒在转染前请混合均匀。

3.取100μl NED3000转移至Opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置15分钟；

注意：NED3000从冰箱取出后，先让其恢复至室温，然后再进行转染操作；在转染前请混合均匀。

4.用枪头轻轻来回吸打上一步混合液3次后，再转移混合液至细胞培养基中，轻轻摇匀，将细胞放回37度培养箱中继续振荡培养2～3小时。

5.添加25ml新鲜完全培养基后继续培养36-72h后检测基因表达。

注意：转染24小时可以检测到目的基因表达，但RNA和蛋白最高丰度表达分别出现在48小时和72小时。