FOX-NY、FOX-NY、FOX-NY细胞、FOX-NY细

（一）细胞总RNA的提取

1、6孔板细胞汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5 min。

2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15 s。

3、室温静置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10 min。

4、12000 rpm，10 min，4 ℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃离心。

5、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10 min， DEPC处理水20-30 μl加入，中枪打匀，55-60 ℃水浴10 min溶解总RNA，测OD值。

6、电泳。

（二）从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）

1、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 μl。

2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀。

3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二级结构）。

4、20-30℃条件下，静置10 min（让Oligotex与mRNA结合）。

5、高速离心2 min，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 μl的上清在原管里。

6、用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1 min。

7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液。

8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 μl热的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4 次，高速离心1 min。

9、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。

10、电泳。


裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法（包括SDS 和溶菌酶处理等）提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。

一、机械裂解法主要有以下两中：

1、热休克（Thermal shock），既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,。

原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。

2、超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。bead-beating 也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高，但通常得到的DNA片段较小。

二、 化学裂解和酶裂解法（在提核酸时联合使用）

主要是裂解液处理法，细胞裂解液的主要目的有以下几种：

（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；

（2）溶解蛋白；

（3）蛋白变性使其稳定；

（4）抑制蛋白酶活性。

主要根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：

50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。7M 尿素，2M Liu脲(可以提高膜蛋白的融解），蛋白酶K等。