MDA-MB-175VII、MDA-MB-175VII、MD

细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。

特点：

1. 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

2. 非常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞 迁移。

3. 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用

4. 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

传统实验方法实验步骤：

1. 培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记（方便拍照时定位同一 个视野）。

2. 细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时可培养一段时间至铺满板底）。

3. 细胞铺满板底后，用1 ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。（人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷。）

4. 吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。

5. 加入无血清培养基，拍照记录。

6. 将培养板放入培养箱培养，每隔4-6小时取出拍照。

7. 根据收集图片数据分析实验结果。

Culture Insert方法
1. 准备细胞，培养液，culture Insert。

2. 如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500 μm宽度的划痕。

3. 每隔4-6小时拍照记录。

4. 根据收集图片数据分析实验结果。

总结：相比较于传统的划痕实验，Ibidi的设计更科学、重现性更好：
实验目的
掌握细胞计数的方法。
了解区分细胞存活状态的方法。

实验用品
0.4%台盼蓝溶液、无水乙醇或95%乙醇溶液、脱脂棉
普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。

实验原理
在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的生活状况。

实验内容与方法
（一）制备动物细胞悬液
将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。

（二）细胞计数
1. 计数板处理
用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。

2. 染色
用滴管吸取0.4%台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数。

3. 计数方法
按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过±5%（图7-1）。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

4. 计数的换算
计完数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01 cm2，高为0.01 cm，这样它的体积为0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml＝1000 mm3，所以每一大方格内细胞数×10 000＝细胞数/ml，故可按下式计算：
细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4×10 000
如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。
计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。
注意事项：
向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片则失败，需重做，过少易出现气泡；不理想时，应重做；
镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。

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