噻唑兰

噻唑兰  MTT

产品货号：0793-1
储存条件：冰袋运输。4℃避光干燥保存。
产品描述
噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种黄色染料，已经普遍替代传统的台盼蓝染色法或者放射性同位素插入法，用来检测细胞的活力，细胞增殖以及细胞毒性分析。检测原理在于：MTT是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。甲臜结晶可用DMSO或者酸化的异丙醇溶解出来，酶标仪下测定570nm的吸光度反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。
MTT也可用作免疫组化/细胞化学染色试剂，也可用来检测NAD。MTT被快速还原成甲臜后，能够螯合镍，铜和钴。钴螯合物可参与机体氧化系统。
产品性质

使用方法（以96孔板为例）
细胞生长的培养条件会影响检测结果，因此进行MTT检测时需考虑这些条件，包括：培养时间，传代次数以及生长培养基的成分等。一般情况，48-72h培养时间下，最初铺板的细胞密度可控制在5000-10,000/孔。


【注】
最终检测的培养液内含有酚红会严重影响检测结果。推荐MTT检测时细胞培养在无酚红环境下。也可以在进行MTT孵育的时候改用无酚红培养液。
A．工作液配制
1）MTT溶液
生化研究中，常配制成5mg/mL的储备液。MTT最好现配现用，可以称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，4℃ 避光短时间保存。建议小剂量分装放到-20℃长期保存，避免反复冻融。
2）SDS-HCl溶液（MTT终止液）
取10 mL 0.01 M HCl加入1 g SDS，颠倒混匀或者超声使其完全溶解，此时即为终止液。建议现配现用。
B．MTT细胞增殖检测
1）接种细胞：用含10%胎牛血清（FBS）的培养液配制成单个细胞悬液，调整细胞密度，以每孔5000-10, 000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 µL，培养板的边缘孔用无菌PBS填充。设置空白对照孔（不含有细胞）。
2）37℃，5% CO2，培养24-72 h。
3）可选：对于贴壁细胞，去除旧的培养液，更换100 µL/孔新鲜的培养液（不含酚红）；对于悬浮细胞，离心96孔板，去除尽可能多的上清液。然后加入 100 µL/孔新鲜的培养液（不含酚红）重悬细胞；
4）每孔加入10 µL MTT溶液（5 mg/mL），加样时尽量勤换枪头，控制加量误差。
5）水平摇床上低速混匀1 min后，放入37℃培养箱孵育4h。【注】：对于高密度的细胞（>100,000 cells/孔）可缩短孵育时间至2 h。
6）对于贴壁细胞，直接吸掉旧的培养液，避免枪尖刮破单细胞层。对于悬浮细胞，离心收集细胞，去除培养液。
7）加入100 µL/孔SDS-HCl溶液，用枪充分混匀后放入37℃培养箱孵育4 h。【注】：更长的孵育时间会降低检测灵敏度。
8）孵育结束，放置在酶标仪上摇匀后，选择570 nm，测定吸光度。记录结果，比色以空白调零。
【注】
对于细胞毒性检测，以未经药物处理细胞的OD值为100%，然后计算药物处理细胞所占的比率（x），公式如下：OD（未处理细胞）/OD（药物处理细胞）=100%/x。然后建立直方图。


注意事项
1）溶解甲臜的有机溶剂具有毒性，使用时注意防护。
2）MTT有致癌性，应小心操作；MTT溶液需要无菌，因其对菌很敏感。MTT溶液不可4℃保存超过1周，因其可能发生降解，导致检测结果错误。
3）MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途！