- ￥800
- LABLEAD
- 北京
- G0060
- 2025年12月17日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 供应商：
LABLEAD
- 规格：
300T
Abs/Em (nm)：555/565
存储温度：-20℃干燥、避光保存，有效期见外包装。若配制成水溶液，应小量分装保存。
注意事项
本产品为冻干粉形式，微量不易观察，使用前请瞬时离心，加适当溶剂溶解后使用，溶解后的溶液近乎透明色。
产品简介
鬼笔环肽是从致命的伞形毒蕈蘑菇中分离出来的一种毒素。 它是特异性结合于F-肌动蛋白的双环肽。因此用荧光染料标记的鬼笔环肽可以非常方便的研究F-肌动蛋白的分布。鬼笔环肽内部，在半胱氨酸和色氨酸之间含有不常见的硫醚桥形成内环结构。在pH升高时，该硫醚被裂解，鬼笔环肽失去对肌动蛋白的亲和力。
荧光标记的鬼笔环肽可在纳摩尔水平染色F-肌动蛋白。在各种植物细胞或动物细胞中，标记的鬼笔环肽对大、小细丝具有相似的亲和力，平均每个肌动蛋白亚基结合一个鬼笔环肽分子。不同于抗体，鬼笔环肽与肌动蛋白的结合亲和力在不同物种间没有显着变化。非特异性染色可以忽略不计，染色和未染色区域之间的对比度非常大。鬼笔环肽将单体/聚合物的平衡转向聚合状态，将聚合临界浓度降低至30倍。Phallotoxins可通过抑制细胞松弛素的解聚， 碘化钾和升高的温度，稳定 F-肌动蛋白，。因为鬼笔环肽缀合物很小，大约直径12-15埃，分子量<2000道尔顿，多种肌动蛋白结合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌钙蛋白依然可以和鬼笔环肽标记的肌动蛋白结合。更重要的是， 鬼笔环肽标记的肌动蛋白丝保持功能，标记甘油肌纤维仍然收缩，标记的肌动蛋白丝仍然可以继续移动。而且荧光标记的鬼笔环肽也可用于对细胞中 F-肌动蛋白进行定量研究。
实验方法
储液制备
荧光染料标记的鬼笔环肽：取适量甲醇或无菌水溶解棕色管中冻干的粉末，制备成200 T/mL的储液（300T规格染料加入1.5 mL的液体，50T规格染料加入0.25 mL的液体即可）。
荧光标记鬼笔环肽的一个单位（T）的定义是染色一个加载细胞的载玻片所用染料的量。 对于荧光标记的鬼笔环肽，使用时的推荐稀释比例为1:40-1:200，一个单位相当于200 μL总染色体积中加入1-5 μL 200T/mL储备溶液。
注：稀释比例可以根据实际染色效果进行适当调整。
固定细胞染色
以下方案是针对生长在玻璃盖玻片或8孔室玻片上的贴壁细胞的染色步骤。鬼笔环肽也可用于染色固定的冷冻或石蜡组织切片。
1. 用PBS清洗细胞3次。
2. 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定细胞，冰上固定15 min。
注意：甲醇可以在固定过程中破坏肌动蛋白。因此最好避免含有任何甲醇的固定剂。优选的固定剂是不含甲醇的甲醛。
3. 用PBS清洗细胞3次。
4. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室温下透化细胞10 min。
5. 用PBS清洗细胞3次。
6. 用200μL PBS稀释1-5 μL荧光标记的鬼笔环肽储液，加入一个盖玻片或孔中，室温孵育20min，进行染色。
注：染色体积可根据样本情况进行调节。孵育过程中为避免染液挥发，可将盖玻片放于密封容器内。
7. 用PBS清洗细胞2-3次。
8. 荧光显微镜观察。标记的鬼笔环肽具有很好的光稳定，样品可以在PBS中成像，但为了效果最佳，也可以使用抗荧光淬灭剂观察。
活细胞染色
荧光标记的鬼笔环肽不具有细胞透性，因此没有被广泛用于活细胞标记。然而，有报道称活细胞可能通过胞饮或未知机制进行标记。一般来说，染色活细胞时需要更多的染料。或者，荧光标记的鬼笔环肽也可被注入到细胞中用于监测肌动蛋白分布和细胞运动。
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文献和实验性荧光标记探针，避免了上述四大假阳性： 1. 非亲脂性染料，无聚集趋势，避免了因染料聚集带来的假阳性； 2. 不弥散，仅标记外泌体膜轮廓，且经过标准protocol可完全去除，不误标记细胞膜；避免了因染料弥散进入细胞带来的假阳性； 3. 不二次标记，偶然脱落的EvLINK会立刻失活，不会二次标记细胞膜，避免了染料脱落后二次着色细胞膜带来的假阳性； 4. 膜特异性，不标记脂质杂质，避免了非外泌体标记带来的假阳性。 Fig.8 EvLINK 505标记外泌体+CellLINK 555
微丝的显示方法步骤：1. 用PBS液漂洗盖片培养的原代细胞3次，每次30s； 2. 用2%的甲醛/PBS液固定原代细胞3min； 3. 用0.5%的三硝基甲苯/PBS处理3次，每次10min； 4. PBS漂洗3次； 5. 用罗丹明(rhodamine)标记的鬼笔环肽(phalloidin)(1：10)室温中反应15min； 6. PBS漂洗3次； 7. 60%甘油+荧光防淬剂封片； 8. 荧光显微镜观察； 微管的显示方法：
感；良好的稳定性和活性染料的标记率。Alexa Fluor 488在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4~10）；FITC激发波长488nm，最大发射波长525nm；缺点荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。橙红色（543-555nm处激发） CF 543、AlexaFluor 546、ATTO550, Cy 3,DyLight 549, Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色荧光染料；CF ? 543 荧光条带明亮，耐光，水溶性好，确保了CF 543染料与抗体的耦联物
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