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2-8℃
5ml
名称 | 体积 | 配方 |
Lysis Buffer | 1L | 50 mM NaH2PO4 (7.80 g NaH2PO4·2H2O) 300 mM NaCl (17.54 g NaCl) 10 mM imidazole (0.68 g imidazole) |
使用 NaOH 溶液调节 pH 至 8.0, 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 |
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Wash Buffer | 1L | 50 mM NaH2PO4 (7.80 g NaH2PO4·2H2O) 300 mM NaCl (17.54 g NaCl) 20 mM imidazole(1.36 g imidazole) 使用 NaOH 溶液调节 pH 至 8.0, 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 |
Elution Buffer | 1L | 50 mM NaH2PO4 (7.80 g NaH2PO4·2H2O) 300 mM NaCl (17.54 g NaCl) 250 mM imidazole (17.0 g imidazole) 使用 NaOH 溶液调节 pH 至 8.0, 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 |
名称 | 体积 | 配方 |
Lysis Buffer | 1L | 8 M Urea (480.50 g urea) 100 mM NaH2PO4 (15.60 g NaH2PO4·2H2O) 100 mM Tris·HCl (15.76 g Tris·HCl) 使用盐酸溶液调节 pH 至 8.0, 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 |
Wash Buffer | 1L | 8 M Urea (480.50 g urea ) 100 mM NaH2PO4 (15.60 g NaH2PO4·2H2O) 100 mM Tris·HCl (15.76 g Tris·HCl) 使用盐酸溶液调节 pH 至 6.3, 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 |
Elution Buffer | 1L | 8 M Urea(480.50 g urea) 100 mM NaH2PO4(15.60 g NaH2PO4·2H2O) 100 mM Tris·Cl(15.76 g Tris·Cl) 使用盐酸溶液调节 pH 至 4.5, 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 |
问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22 or 0.45 μm)过滤,或者 离心去除。 |
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加 DNaseI (终浓度 5 μg/ml),Mg2+ (终浓度 1 mM),冰上孵 育 10-15 分钟。 |
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样品太粘稠 | 有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油 | |
洗脱组分中没有 目的蛋白 |
蛋白可能是包涵体,没有在上清中 | 可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否 含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体 蛋白的纯化方式。 |
表达量太低 | 优化表达条件。 | |
目的蛋白结合比较弱,在 洗杂步骤被洗下来了 |
提高wash Buffer的pH,或者降低咪唑浓 度。 |
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目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来 | 降低Elution Buffer的pH值,或者增加 Elution Buffer中咪唑浓度。 |
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使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子,同 时得到目的蛋白。 |
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蛋白降解 | 菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4°C下进行纯化操作。 | |
洗脱组分不纯(含 有多种蛋白) |
洗杂不彻底 | 增加Wash Buffer体积。 |
样品中含有其他的组氨酸 标签蛋白 |
通过调节pH值,或者咪唑浓度来优化洗杂 条件。再使用其他的纯化手段(如离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。 |
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填料呈现褐色 | 缓冲液中含有DTT等还原 剂 |
参考表2,适当降低还原剂DTT的浓度,或 者改用巯基乙醇。 |
上样过程中蛋白 发生沉淀 |
操作温度太低 | 室温下进行上样。 |
蛋白发生聚集 | 在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂,如 0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。 |
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