T4连接酶

产品货号：T5205
储存条件：-20℃
产品组成

组分	规格
T4 DNA Ligase(Fast)(5U/ul)	200ul
10×T4 DNA Ligase Buffer	1ml
50% PEG	1ml

注：1U=1 Weiss unit
产品简介
T4 DNA Ligase(Fast)由携带T4噬菌体gene30的大肠杆菌产生。该酶催化双螺旋DNA或RNA之间的5'-磷酸基团和3'-羟基之间形成磷酸二酯键。该酶在双链DNA、RNA或者DNA/RNA复合物间可修复单链缺刻，并且可以连接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但对于单链核酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物DNA片段克隆、基因定点突变与PCR产物克隆、修复双链DNA缺刻与线性DNA自环化。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接反应仅需10分钟。
酶活单位定义
37℃条件下，1 Weiss unit的酶在20min内催化1nmol的[PPi]转变为活性炭吸附态。1 Weiss unit等同于约200个粘性末端连接反应单位（CEU），相当于在16℃条件下，30min内连接50% HindIII消化后的λDNA片段。
酶活检测条件
酶活在如下反应混合物中进行测试：66mM Tris-HCl(pH7.6)，6.6mM MgCl，0.066mM ATP，10mM DTT，3.3μM[32PPi]。



质量控制
核酸量内控切酶制残留测试
37℃条件下，将200U的T4 DNA Ligase(Fast)与1ug的pUC19DNA中温育4h，未检测出共价闭合环状DNA转变为带有缺刻的DNA。
核酸外切酶残留检测
将酶液与双链DNA底物在37℃温育16h，通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化。
蓝白斑测试
室温条件下，使用30U T4 DNA Ligase连接pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化产物1h，然后用E.coli XL1-Blue感受态细胞转化连接产物，检测到少于1%的白斑。
使用方法
1.DNA插入片段连接至载体DNA（粘性末端连接）
1）于冰上配制如下反应体系：

试剂	使用量
线性化载体DNA	20~100ng
插入片段DNA	3:1~10:1（片段：载体摩尔比）
10×T4 DNA Ligase Buffer	2ul
T4 DNA Ligase(Fast)	1U(0.2ul)
Nuclease-FreeWater	To 20ul

2）充分混匀并瞬离，22℃温育10min；
3）取1~5ul的连接产物用于50ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2ul用于50ul电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。




2.DNA插入片段连接至载体DNA（平末端连接）
1）于冰上配制如下反应体系：

试剂	使用量
线性化载体DNA	20~100ng
插入片段DNA	3:1~10:1（片段：载体摩尔比）
10×T4 DNA Ligase Buffer	2ul
50% PEG	2ul
T4 DNA Ligase(Fast)	5U(1ul)
Nuclease-Free Water	To 20ul

2）充分混匀并瞬离，22℃温育1h；
3）取1~5ul的连接产物用于50ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2ul用于50ul电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
1. 线性DNA自环化
1）于冰上配制如下反应体系：

试剂	使用量
线性化DNA	10~50ng
10×T4 DNA Ligase Buffer	5ul
T4 DNA Ligase(Fast)	5U(1ul)
Nuclease-Free Water	To 50ul

2）彻底混匀并瞬离，22℃温育10min；
3）取1~5ul的连接产物用于50ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2ul用于50ul电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
2.接头连接
双链寡核苷酸接头经常被用于在插入片段上产生粘性末端。接头通常包含限制酶识别位点，在连接后经酶切处理产生和克隆载体匹配的粘端。有时候接头已包含与克隆载体匹配的粘端，此时无需在接头连接完成后进行插入片段的进一步处理。



1）于冰上配制如下反应体系：
 

试剂	使用量
线性化DNA	100~500ng
磷酸化接头	1~2ug
10×T4 DNA Ligase Buffer	2ul
50% PEG	2ul
T4 DNA Ligase(Fast)	2U(0.4ul)
Nuclease-Free Water	To 20ul

2）彻底混匀并瞬离，22℃温育10min；
3）在65℃作用10min或者70℃作用5min，进行热失活。
注：添加1mM ATP的条件下，T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切缓冲液中具有100%活性。因此，接头连接反应时可以在LabFD™酶切缓冲液中进行，以简化“接头连接-酶切”实验流程。具体方法为：接头连接反应完成后，先失活T4 DNA Ligase，然后向该体系中添加ATP至终浓度1mM，再在体系中加入适量的LabFD™快速内切酶，最后使用最适酶切反应温度进行温育即可。
注意事项
1）T4 DNA Ligase在浓度高于200mM的NaCl或KCl中会被强烈抑制；
2）连接反应液添加量不应该超过感受态细胞体积的10%，不推荐体系中加入过量的T4 DNA Ligase；
3）与T4 DNA Ligase结合的DNA可能会在琼脂糖凝胶中出现带移或弥散，为了避免此现象，可以在上样前对酶进行热失活，必要时加入适量的SDS；
4）聚乙二醇（PEG）能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG8000的推荐添加量是连接体系的5%（w/v）；
5）电转化效率可能通过对T4 DNA Ligase热失活或者使用离心柱或者氯仿抽提纯化DNA方式来提高；
6）转化子数目可通过延长反应时间至1h而增加。