GFP-Nanoab-Magnetic beads

货号：GNM-25-1000
储存条件：可在 4℃保存半年，避免离心，干燥，长时间保存可冻存。
产品描述
偶联 anti-GFP 纳米抗体的磁性纳米微球用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。
产品优势
l 没有普通抗体的轻链和重链；
l 高亲和力：解离常数达到 pM 级别；
l 高载量：20μl 的 slurry 可以结合 2-4μg GFP 蛋白；
l 较短的孵育时间，结合 5-30 min 即可；
应用范围
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等。
特异性
可以结合GFP、EGFP、YFP和EYFP等。
产品特性
存储缓冲液：PBS(含有20%乙醇)。
保存条件：可在4℃保存1年(确保完全密封)，或在-80℃长期保存，避免反复冻融。

实验步骤：

收集细胞
每个免疫沉淀反应大约使用 10⁶-10⁷的哺乳动物细胞（约一个10厘米培养皿），表达绿色荧光蛋白融合蛋白。
吸出培养基，向培养皿中加入预冷的1×PBS，漂洗2次，利用细胞刮或胰酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500g离心3分钟并丢弃上清液。

细胞裂解
1．在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，用500μl预冷的裂解缓冲液重悬细胞。
2．把离心管放置在冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次。
3．4℃，20,000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。
  注意：此时细胞裂解产物可长期保存于-80℃。
平衡珠子
4．振荡混匀 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，吸取40ul slurry到500ul预冷的裂解缓冲液中，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。（此步骤可选）
结合蛋白
5．将细胞裂解产物加入到平衡的GFP-Nanoab-Magnetic Beads中（如果未做第4步，可在细胞裂解产物中直接加入40ul slurry），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合30-60min。如果需要，保存 50ul的裂解产物进行免疫印迹分析。
6．在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。如果需要，保存50ul上清液进行免疫印迹分析。
清洗珠子
7．用 500ul预冷的裂解缓冲液中重悬 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液并重复洗涤2次。（可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到500mM）。
洗脱蛋白
方法一：
8．加入20ul 2X SDS-sample buffer 重悬 GFP-Nanoab-Magnetic Beads。
在 95℃，10min条件下，加热GFP-Nanoab-Magnetic Beads，把免疫沉淀复合物从珠子上游离出来。GFP-Nanoab-Magnetic Beads可在磁力架上进行分离，收集的产物可以进行SDS–PAGE分析。

方法二：
替代步骤8和9的可选步骤：加入50ul 0.2M pH2.5的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，随后用磁力架进行分离，转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘氨酸，需添加5ul 1.0M Tris（pH10.4）。
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。
可选实验方案
方案一：
如需进行GFP融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。
方案二：
如需进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，主要用于含有GFP融合蛋白的蛋白质/DNA相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，联反应的逆转，DNA的纯化以及DNA的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第5步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到GFP-Nanoab-Magnetic Beads上；进入第6和7步，分离得到复合物；进入第9步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA的纯化及DNA的鉴定等同于普通的ChIP实验。RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。
方案三：
GFP-Nanoab-Magnetic Beads不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用，也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行SDS–PAGE分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。