产品描述
His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶是由高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。
产品特点
基质 |
高度交联的4%琼脂糖微球 |
载量 |
>40 mg 6xHis蛋白 |
粒径 |
45-165μm |
储存&稳定性 |
2‐8℃储存24个月 |
储存缓冲液 |
20% 乙醇 |
体积 |
10mL (5mL凝胶) |
纯化步骤
1. 准备buffer
平衡缓冲液:50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,用NaOH 调pH为8.0
洗涤液: 50mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM咪唑,用NaOH 调pH 为8.0
洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,250 mM 咪唑,用NaOH 调pH 为8.0
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2. 样品准备
以大肠杆菌表达系统为例
1). 4℃离心30 分钟(4000 g)收集菌体,弃上清。
2). 用冷平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要,可加入适量的添加剂,如蛋白酶抑制剂(PMSF)或其他蛋白酶抑制剂等。
注意:加入的抑制剂不能对Ni-IDA 亲和层析介质的性能有影响,破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂,DTT、巯基乙醇等还原剂,尿素、盐酸胍等变性剂。
3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全。
可选:如果裂解物太粘稠,可以加入RNase A (终浓度10 μg/ml) 和DNase I (终浓度5 μg/ml) 并在冰上孵育10-15分钟。
4) 4℃离心20分钟(12,000 g),除菌过滤,并小心将上清和沉淀分离。
5).用SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。
3.纯化重组His融合蛋白
1). 轻轻重悬His琼脂糖凝胶。
2). 吸取适量的His琼脂糖凝胶至重力柱中,用5-10 倍柱体积的冷平衡缓冲液平衡His琼脂糖凝胶。
3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到层析柱中,流速控制为0.5-1 ml/min,
4). 裂解菌液全部流出层析柱后就立刻加入洗涤液清洗层析柱,所需量大约为柱体积的10-20 倍或者直到流出液的A280 值达到最低且稳定;
5). 用5-10 倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5-1ml/分钟的流速洗脱,收集洗脱液。或者根据流出液A280 值判断,当数值陡然上升时开始接收洗脱液,直到A280 数值降至最低且稳定停止收集。根据目的蛋白的性质和用途选择透析到20 mMTris-HCl,pH 8.0 或者1 ×PBS,pH 7.4 中。
4.树脂再生及储存
His标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着使用次多较多,非特异性结合的蛋白增多和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下降,这时需要对树脂进行清洗。
按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。
1) 使用 5 倍柱体积去离子水清洗填料;
2) 使用 5 倍柱体积 100 mMEDTA (pH 8.0)剥落镍离子;
3) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料;
4) 使用5 倍柱体积0.5M NaOH 清洗,
5) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料;
6) 使用 3-5 倍柱体积 100 mMNiSO4 再生挂镍;
7) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗;
填料再生后,可以立即使用,如不立即使用,需要将填料悬浮于等体积的 20%乙醇中,置于 2-8°C 保存。