产品描述
GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶是由高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,用于纯化各种表达系统融合表达的GST重组蛋白。
产品特点
基质 |
高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体 |
谷胱甘肽 |
载量 |
>30 mg GST蛋白(30 kDa) |
粒径 |
45-165μm |
储存&稳定性 |
2‐8℃储存24个月 |
储存缓冲液 |
20% 乙醇 |
体积 |
10mL (5mL凝胶) |
纯化步骤
1. 准备buffer
结合液:PBS, pH 7.4
洗脱液:50 mM Tris-HCl, 10 mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.0
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
注意: 结合液和洗脱液中可加入1–10 mM DTT。
2. 样品准备
以大肠杆菌表达系统为例
1). 4℃离心30 分钟(4000 g)收集菌体,弃上清。
2). 用冷1×PBS 重悬细胞, 如果需要,可加入适量的添加剂,如非离子去污剂(NP-40)或蛋白酶抑制剂(PMSF)等。
3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全。
4) 4℃离心20分钟(12,000 g),除菌过滤,并小心将上清和沉淀分离
5).用SDS-PAGE 分析GST 融合蛋白的含量及可溶性。
3.纯化重组GST 融合蛋白
1). 轻轻重悬GST琼脂糖凝胶。
2). 吸取适量的GST琼脂糖凝胶至重力柱中,用10 倍柱体积的冷1×PBS(4°C)平衡GST琼脂糖凝胶。
3). 将制备好的含有GST 融合蛋白澄清菌液加入到层析柱中,流速控制为10-15cm/h
4). 裂解菌液全部流出层析柱后就立刻加入1×PBS清洗层析柱,所需量大约为柱体积的20 倍。
5). 用现配洗脱液洗脱融合蛋白,所需量大约为柱体积的10-15 倍.
6). 分别吸取20-50 μl GST 融合蛋白原液、流出液、洗涤液和洗脱液,通过SDS-PAGE 电泳分析各样品,确认是否存在蛋白
7). 洗脱液可以通过4℃透析或者分子筛去除游离的谷胱甘肽.。
4.树脂再生及储存
1).GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着使用次多较多,非特异性结合的蛋白增多和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下降,这时需要对树脂进行清洗。
a.去除一些沉淀或变性物质
用 2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用5 倍柱体积的PBS, pH 7.4 清洗。
b.去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用 3-4倍柱体积的70%乙醇或2 倍柱体积的1% Triton™X-100 清洗,然后然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。
然后加入20%乙醇4℃保存。