NHS磁珠(Mag-NHS)
产品描述
Mag-NHS表面为NHS基团修饰,能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键,用于亲和纯化抗体、抗原和其他生物分子。与传统的羧基、氨基磁珠相比,表面含NHS基团的磁珠无需先采用EDC/NHS或戊er醛进行活化,只需简单地将含伯氨基的生物配体溶解在试剂盒推荐的Coupling Buffer中,室温下将蛋白与NHS磁珠混合1~2 h便可将生物配体共价偶联到磁珠上,具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效等优点。磁珠偶联过程必须在不含任何氨基的缓冲溶剂中进行。人工操作时,使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离。也可采用自动化设备操作,自动化操作适合用于多样品的筛选。
以下操作过程以磁珠样品500 μL,采用1.5 mL EP管为例介绍。用户可根据自身需求按比例调整:
1. 取适量待偶联蛋白用Coupling Buffer溶解,配成浓度为0.1-2.0mg/mL的蛋白溶液。已经保存于buffer中的蛋白,需要通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质,然后再用Coupling Buffer配成浓度为0.1-2.0 mg/mL的蛋白溶液,将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用。
注: (1)为了达到更好的性能,当蛋白浓度≥2 mg/mL 时,此时偶联效率会更高,不过需根据成本和使用要求综合考虑;
(2)蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分,比如 Tris,甘氨酸,明胶,BSA等;
2. 取500 μL磁珠于1.5 mL EP管中。
注:磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器或者垂直混合仪使其混合均匀,以保证实验的同一性。
3. 将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,去除上清液。
4. 加1 mL 2~8ºC的预冷的Washing Buffer 于1.5 mL EP管中,涡旋15 s,使磁珠混合均匀。
5. 将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,去除上清液。
6. 加500 μL蛋白溶液于EP管中,涡旋30 s,使其混合均匀。
7. 将EP管涡旋15 s,置于垂直混合仪上,室温混合1~2 h。如果垂直混合不均匀,则反应前30 min,每隔5 min 取下EP管涡旋15 s。此后,每隔15 min,取下EP管涡旋15 s。
8. 采用磁性分离架富集磁珠,保存流穿液。
9. 加1 mL Blocking Buffer A于EP管中,涡旋30 s,将EP管置于垂直混合仪中室温反应2 h,再加入1 mL Blocking Buffer B于EP管中,涡旋30 s,将EP管置于垂直混合仪中室温反应1 h。
注:封闭这一步可以采用二次封闭,第一步封闭采用试剂盒中自带的Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH 8.0),也可使用其它封闭液封闭,封闭时间不得低于 2 h。
10. 将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,弃上清液。加1 mL超纯水于EP管中,充分混合,用磁力架富集磁珠,弃上清液。重复该操作2次。
11. 最后加入500 μL Storage Buffer于EP管中,充分混合,4º保存备用。
注意事项
1.磁珠对水敏感。为了保证产品质量,在取样之后需立即盖上瓶盖,并用封口膜密封,于4℃保存。
2. 禁止将磁珠干燥或冷冻。干燥和冷冻操作可能导致磁珠的聚集从而丧失结合活性。
3. 可通过间接法测定反应前后蛋白含量,或通过直接法检测偶联到磁珠表面的蛋白含量,使用280 nm附近的波长来测定蛋白含量是不可取的,因为NHS基团在280 nm 波长附近有很强的吸收,会严重干扰检测结果。
4. 蛋白稳定剂(如BSA,gelatin)会抑制抗体与磁珠的结合,因此在磁珠偶联抗体过程中,需要确保抗体保存体系中不存在含伯氨基的蛋白稳定剂。
5. 缓冲液中含有带伯胺的物质会抑制蛋白质偶联到磁珠表面,去除伯胺物质可采用透析和脱盐的方法。
6. NHS基团易水解,故在用Washing buffer洗涤时,一定要参照说明书进行。
7. 蛋白溶液要预先配制好,Washing buffer洗涤完毕后,要立即加入蛋白溶液进行偶联反应。