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现货
活性氧 Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒
1年
恒斐生物
在零下15度以下保存, 避免光照
200 Tests
货号 | 16055 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
规格 | 200 Tests | 价格 | 3840 |
Ex (nm) | 576 | Em (nm) | 598 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
适用仪器
荧光显微镜 | |
激发: | Cy3/TRITC滤波片 |
发射: | Cy3/TRITC滤波片 |
推荐孔板: | 黑色透明 |
荧光酶标仪 | |
激发: | 540nm |
发射: | 590nm |
cutoff: | 570nm |
推荐孔板: | 黑色透明 |
96孔板分析示例
概述
准备细胞用MitoROS OH580工作溶液
在37ºC孵育细胞60分钟
用测试化合物孵育细胞(诱导OH·)
在Ex / Em = 540/590 nm处检测荧光增加
注意:使用前在室温下解冻所有组件。
操作步骤
1.准备细胞:
1.1对于贴壁细胞:在生长培养基中将细胞过夜,10,000至40,000个细胞/孔/90μL用于96孔板或2,500至10,000个细胞/孔/20μL用于384孔板。
1.2对于非贴壁细胞:从培养基中离心细胞,将细胞沉淀悬浮于培养基中,100,000-200,000细胞/孔/90μL,96孔poly-D赖氨酸平板或25,000-50,000细胞/孔/ 对于384孔聚-D赖氨酸板,20μL。 在实验之前,在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。
注意:应对每个细胞系进行单独评估,以确定最佳细胞密度。
2.准备MitoROS OH580方案:
2.1Prepare MitoROS OH580储备液(500X):将50μLDMSO(组分C)加入MitoROS OH580(组分A)的小瓶中,并充分混合。
注意:25μL重组的MitoROS OH580原液足以容纳1个平板。 如果管子密封并且避光,可以将未使用的部分等分并在≤-20℃下储存超过一个月。避免反复冻融循环。
2.2准备MitoROS OH580工作溶液:将25μL500XDMSO重构的MitoROS OH580储备溶液(来自步骤2.1)加入10 mL分析缓冲液(组分B)中,并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。
3.进行羟基自由基测定:
3.1取出培养基,加入100μL/孔(96孔板)或25μL/孔(384孔板)的MitoROS OH580工作溶液(步骤2.2)到细胞板中。将细胞在37ºC孵育1小时。
3.2为了诱导羟基自由基,用37℃的所需缓冲液(如PBS或HHBS)中的文本化合物处理细胞一段所需的时间,避光。
注意1:我们用芬顿反应(10μMCuCl2和100μMH2O2)在37℃处理HeLa细胞1小时,以诱导外源性羟基自由基。详细信息请参见图1。
注意2:我们用生长培养基中的(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)在37℃下处理RAW 264.7细胞4小时,以刺激内源性羟基自由基。详细信息请参见图2。
3.3用HHBS或DPBS将细胞洗涤2-3次,并向每个孔中加入100μL测定缓冲液(组分B)。
3.4使用具有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察细胞中的荧光信号,或使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm(截止= 570nm)下以底部读取模式测量荧光增加。
数据分析
图1.使用MitoROS OH580(Cat#16055)在HeLa细胞中测量羟基自由基的荧光图像。 将HeLa细胞与MitoROS OH580工作溶液在37℃下孵育1小时,然后用HHBS洗涤一次。 芬顿反应:然后将细胞用10μMCuCl2和100μMH2O2在1X HBSS缓冲液中于37℃处理1小时。 对照:将HeLa细胞保持在1X HBSS缓冲液中而不进行处理。 用HHBS洗涤3次后,使用具有TRITC过滤器组(红色)的荧光显微镜测量HeLa细胞。 细胞核用Hoechst 33342(Cat#17530,Blue)染色。
图2.使用MitoROS OH580(Cat#16055)检测RAW 264.7细胞中的细胞内羟基自由基。 将细胞与MitoROS OH580工作溶液在37℃下孵育1小时,然后用HHBS洗涤一次。 然后将细胞在没有或与PM2A(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯,10-500ng / mL)在生长培养基中于37℃温育4小时。 用HHBS洗涤3次后,使用具有TRITC过滤器组的荧光显微镜测量HeLa细胞。
参考文献
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