韩国安捷Bionote动物疫病检测试剂盒

猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒

（此说明书仅供参考，以包装内英文说明书为准！！）

 

1、 疾病概况

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科成员。它可以使任何年龄段的猪出现急性肠炎，对新生仔猪通常是致死性的。该病与传染性胃肠炎病毒（TGEV）有着相似的临床症状。

该病在大部分欧洲国家和中国广泛存在。1969年该病在欧洲大流行；在1969年前收集的猪血清中没有出现相应的抗体。自此，该病在多个欧洲国家广泛传播并流行，大爆发则较少发生。在大型的养殖场内，病毒持续存在于断奶和失去母源抗体免疫力的仔猪体内。在这些场里，病毒可能与断奶腹泻有关。病毒主要通过直接接触病猪、间接接触病毒污染物以及经运输卡车传播。

PED的临床症状包括厌食、呕吐、腹泻和脱水。5日龄以下新生仔猪发生感染时，由于发生严重的腹泻和脱水，发病率和死亡率接近100%；而大于10日龄仔猪感染后的发病率和死亡率不足10%。

该病特征性的大体病变是小肠边缘的绒毛变短，且病变局限在小肠，这与TGE的病变相似。结肠无病变。另一常见病变为背部肌肉的急性坏死。

 

2、试剂盒简介

从生产母猪的初乳中检测PED IgA抗体的试验，对PED的防控意义重大。韩国安捷公司的PED IgA抗体ELISA试剂盒内含有已经包被好PED IgA抗原的微孔板。检测时，包被抗原的酶标板与样品孵育，然后与羊抗猪的IgA-HRP酶标物反应。孵育后，在加入底物前用洗液将没有结合的物质清洗干净。反应结合的酶跟样品中初乳的PED IgA抗体的量成正比例。加入终止液终止反应，用酶标仪在450nm和620nm双波长条件下，读取结果。

韩国安捷公司的PED IgA抗体ELISA试剂盒特别选用PED IgA抗原作为包被材料，以更加准确的检测出初乳中的PED IgA抗体。

 

3、试剂盒组成

抗原包被板	5块
阴性对照：SPF小猪血清，Proclin 300 (0.05%)作为防腐剂	1ml
阳性对照：PED IgA抗体，保存于有蛋白稳定剂的磷酸盐缓冲液，Proclin 300   (0.05%)作为防腐剂	1ml
样品稀释液：磷酸盐缓冲液，(0.01%)作为防腐剂	80ml
20倍浓缩洗液： PBS-Tween20 ，Proclin   300 (0.05%)作为防腐剂，	250ml
101倍浓缩的酶标物：羊抗猪IgA-HPR，含BSA和稳定剂Proclin 300 (0.05%)作为防腐剂。	1ml
酶标物稀释液：PBS，含有BSA和稳定剂，Proclin 300 (0.05%)作为防腐剂。	80ml
TMB显色剂：含有TMB和H2O2的柠檬酸盐缓冲液 ，已准备好待用	80ml
终止液：1 N的硫酸，直接使用	80ml
封板膜	10块
说明书	1份

 

4、注意事项

为了得到重复性好的结果，必须遵循以下规定。

1）  只用于体外诊断。

2）  不同批号的试剂不能混用。

3）  使用干净的玻璃器皿，避免金属离子或氧化物的污染。

4）  接触潜在感染物和实验操作时，必须使用一次性手套。

5）  使用底物和终止液时要小心，避免让液体接触皮肤、眼睛和粘膜。如果不慎沾上，应立即用自来水彻底冲洗。

 

5、样品收集和保存

1）采集生产母猪的新鲜初乳。

2）如果样本不能立即检测，请冷藏与在2~8℃。若保存时间超过3天的，将样品冻存在-20℃或更低的温度环境中。使用前，请将样品进行回温。

3）出现沉淀物的样品会使结果不一致，试验前务必使样品澄清。

 

6、试剂的准备

1）使用前，将试剂盒的所有试剂恢复到室温。

2）不用稀释阴、阳性对照液和样品。

3）酶标物的准备（101倍浓缩）：使用前，必须将酶标物按1:100进行稀释。（10ul的酶标物加入1ml的酶标物稀释液中进行稀释，并充分混匀。）

4）洗液的准备（20倍浓缩）：使用前，必须用蒸馏水或去离子水将浓缩清洗液按1:19进行稀释。如果洗液出现结晶物，请将洗液放在37℃处，加热数分钟即可溶解结晶物。（10ml清洗液加入190ml的蒸馏水或去离子水中进行稀释。混匀）

 

7、操作步骤

1）准备好用于样品稀释的酶标板。在每个微孔中加入100ul的样品稀释液。

2）阴、阳性对照液个2个孔，其余各孔为样品孔。

   加入10ul的阴性对照液于A1和B1孔

   加入10ul的阳性对照液于C1和D1孔

   其余各孔加入10ul样品

3）用封板膜封扳，轻轻地振荡酶标板。此步骤对实验结果的重复性很重要。

4）在37℃下，孵育60分钟。

5）用已稀释好的洗液洗板5次，每次350ul。*一次洗板后，拍干板里的水。

6）每孔加入100ul酶标物。

7）在37℃下，孵育30分钟。

8）用已稀释好的清洗液洗板5次，每次350ul。*一次洗板后，拍干板里的水。

9）每孔加入100ul底物。

10）18～25℃下，孵育15分钟。

11）每孔加入100ul终止液终止反应。

12）用酶标仪，在450nm和620nm双波长的条件下，读取吸光值。必须在30分钟内，完成读取结果。读取结果时，酶标板内不能出现气泡。

 

8、数据分析

1）检测的有效性

①　阴性对照的平均OD值<0.200

②　阳性对照的平均OD值>0.500

③　如果上述其中一个值超出了规定的范围，则该实验被视为无效。所检的样品需要重新检测。

 

2）计算判断值

①　用A1和B1孔的吸光值来计算阴性对照的平均OD值。

判断值＝（0.35＋阴性对照的平均OD值）

 

②　根据阴性对照的OD值，样品结果的判断标准如下：

-阳性结果：样品OD值>判断值

-阴性结果：样品OD值<判断值

 

③　举例：

阴性对照平均OD值：0.078

判断值＝0.35＋0.078＝0.428

样品OD值为0.389：样品为阴性

样品OD值为0.894：样品为阳性

 

9、局限性和干扰性

1）检测步骤，注意事项和对结果的判定必须严格按照说明书进行。

2）样品：

①　样品中含有的氮化钠可能会影响测试结果。

②　样品经过巴氏灭菌法（60℃条件下不少于10小时）消毒会降低反应活性，故而不可用于检测。

③　样品经过加热灭活的（56℃，30分钟）并不影响试验结果。

④　抗凝血剂 如肝素，EDTA，柠檬酸盐不会影响试验结果。

⑤　溶血的样品应在使用前需离心，以免被细胞内成分干扰。

⑥　不要使用细菌污染的样品。

3）操作过程中样品加入失败，将会引起假阴性的结果，如临床上有疑似PED病毒感染症状的，建议重复检验。

 

10、保存条件

所有试剂都要保存在2～8℃。

 

11、稳定性

1）不要使用过期的试剂盒

2）试剂的稳定性

试剂	状态	保存	稳定性
酶标物的工作液	制备后	室温	1小时内
		2～8℃	4小时
工作浓度的洗液	制备后	室温	1周
底物工作液	制备后	配好后应立即使用

12、包装规格

96T/盒，480T/盒

 

13、准确性

    板内误差和板间误差取决于检测3个样品的10个平行实验：1个阴性血清、1个弱阳性血清和强阳性血清。阴性、弱阳性、强阳性的误差（C.V%）在10%以内。