弧菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点:
弧菌（Vibrio spp.）是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性
菌。弧菌属广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。该菌引起
的食物中毒经烹饪不当的海产品或盐腌制品所传播。常见的为海蛰、海鱼、海虾
及各种贝类，因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可发生食物中毒。该菌
常年均可发生，可从自限性腹泻至中度霍乱样病症，有腹痛、腹泻、呕吐和低热，
粪便多为水样，少数为血水样，恢复较快，病后免疫力不强，可重复感染，该菌
还可引起浅表创伤感染、败血症等，给人体健康带来严重损害，因此弧菌检测具
有重要的意义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以探
针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测弧菌的通用试剂盒，它具有下列
特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据人弧菌高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA
发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR Magic Mix	500μL（本色盖）
试剂二	荧光PCR专用模板稀释液	1mL（黄盖）
试剂三	弧菌通用探针法qPCR引物混合液	100μL（白盖）
试剂四	弧菌通用qPCR探针	50μL（棕色管）
试剂五	弧菌通用探针法qPCR阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)	50μL（黄盖）
试剂六	天净沙核酸释放剂（试用装）	20 次（1mL，绿盖）
	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期12个月。
自备试剂    样品 DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品
（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行） 
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照管	标准曲线样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
弧菌通用qPCR 探针	1μL	1μL	各 1μL
弧菌通用探针法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	7 μL	不加	不加
超纯水	不加	7 μL	不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	不加	不加	各7μL（2号样到2号管，3 号样到3号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
 

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR 反应 （40 个循环）	94℃	30 sec
	55℃	30 sec（采集 FAM 通道的荧光 信号）
	72℃	30 sec
最后延伸	72℃	10 min

四、数据处理
12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待
测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓
度。
六、电泳检测
13. 如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产
物的大小为 400 bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。