猫支原体探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点:

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。经验丰富的实验技术人员设计探针，对目标基因有高特异性，实验重复性好，灵敏度更高。它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 根据猫支原体保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的莱氏无胆甾原体。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。
6. 本只能用于科研，足够 50 次 20μL 体系的荧光定量 PCR。

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR Magic Mix	500μL（本色盖）
试剂二	荧光PCR专用模板稀释液	1mL（黄盖）
试剂三	猫支原体探针法qPCR引物混合液	100μL（白盖）
试剂四	猫支原体qPCR探针	50μL（棕色管）
试剂五	猫支原体qPCR阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)	50μL（黄盖）
	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期12个月。
自备试剂    样品 DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品
（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行） 
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照管	标准曲线样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
猫支原体qPCR 探针	1μL	1μL	各 1μL
猫支原体探针法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	7 μL	不加	不加
超纯水	不加	7 μL	不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	不加	不加	各7μL（2号样到2号管，3 号样到3号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
 

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR 反应 （40 个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号）
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。