梭菌增菌培养基（2015药典）

产品名称：梭菌增菌培养基（2015药典）
产品用途：用于梭菌的增菌培养和计数
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培养基的保质期各不相同。不同的标准中均有明确规定了保存的条件和保质期。培养基应保存在防止其成分发生变化的环境下，即应避光、干燥保存；如有必要，用保存于2℃～8℃冰箱中，或依据培养基要求的储存条件进行保存。除标准规定或保质期验证实验的结果表明有较长的保质期外，通常平板保存不超过2周～4周，三角瓶和试管的保存不超过3个月～6个月。除标准规定或保质期验证实验的结果表明有较长的保质期外，含有不稳定添加成分的培养基应即配即用。对发生化学反应或含有不稳定物质的固体培养基也应即配即用，不可二次融化。实验室应对贮存培养基的有效期进行规定。观察培养基颜色变化，是否有蒸发/脱水情况，是否有微生物生长。当培养基发生这类变化时，应停止使用。在使用和进一步加热前，应事先将培养基放置到室温。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置。记录所有相关数据，如质量/体积、pH、制备日期、灭菌条件和制备人员等。使用各别成分制备培养基时，应按照配方准确配制，记录所有细节信息，如：培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积（分装体积）、无菌措施（包括实施的方式、温度及时间）、配置日期、人员等，以便溯源。
梭菌增菌培养基（2015药典）相关琼脂培养基的融化：培养基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）融化。经过高压灭菌的培养基尽量减少重新加热的时间，避免过度加热。培养基融化后立即移开，室温静置片刻（约2min)，以免玻璃容器发生破裂。融化后的培养基放人47℃～50℃恒温水浴锅中保温，冷却到47℃～50℃所需的时间取决于培养基的类型、体积和在水在锅里的分装量。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不超过4h。剩余的培养基凝固后不得再次融化使用。特别是灵敏性培养基，应根据相关标准，缩短融化后放置的时间。将琼脂培养基倒人类似检测培养基使用的独立容器中，插入温度计，记录并保存琼脂的融化、温度。加入样品的培养基应将温度调节到44℃～47℃，或按照相关标准调节温度。水浴保温的顶层培养基中依次加入测试增菌液0.1 mL(需活化时另加10％S9混合液o．5 mL)，混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平板，使顶层培养基在底层分布均匀。平放固化后取无菌滤纸片(直径约为6 mm)，小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物(如10μL)，点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面；37℃培养48 h观察结果。

梭菌增菌培养基（2015药典）相关菌种衰退的根本原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。
此外，菌种衰退还有以下几种原因：
1、表型延迟造成菌种衰退，表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。
2、质粒脱落导致菌种衰退，质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响(如高温)，致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。
3、连续传代，连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变(尤其是负突变)的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
4、不适宜的培养和保藏条件，不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。

梭菌增菌培养基（2015药典）相关菌种的复苏与传代 
1.以无菌操作方式开启冻干菌种管，加入适量培养液（按菌种选择培养液，如细菌选择营养肉汤、白色念珠菌选择沙堡液体培养基、分枝杆菌选择苏通综合液体培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏营养肉汤培养基），吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0 mL～10.0 mL相应培养液的试管，滴入少许菌种悬液，在适宜温度下培养至规定时间（一般为36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h、黑曲霉菌为30 ℃± 1℃培养42 h～48 h），此为第1代培养物。
2.用接种环取第1代培养物，或从菌种冻存管中取适量菌液/瓷珠，划线接种于相应培养基平板（按菌种选择培养基，如细菌选择营养琼脂培养基、白色念珠菌选择沙堡琼脂培养基、分枝杆菌选择改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂培养基、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基），在适宜温度下培养至规定时间（一般为36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h、分枝杆菌36 ℃± 1℃培养72 h、黑曲霉菌30 ℃±1 ℃培养42 h～48 h），此为第2代培养物。
3.挑取第2代培养物中典型菌落，接种于相应培养基斜面或平板（按菌种选择培养基斜面，如细菌选择营养琼脂斜面、白色念珠菌选择沙堡琼脂斜面、分枝杆菌选择改良罗氏培养基或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂斜面、黑曲霉菌选择麦芽浸膏琼脂培养基平板），在适宜温度下培养至规定时间（一般为36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h、分枝杆菌36 ℃±1 ℃培养72 h、黑曲霉菌30 ℃±1 ℃培养42 h～48 h），此为第3代培养物。
4.取第3代培养物，接种于相应培养基斜面，在适宜温度下培养至规定时间，此为第4代培养物。5.1.5 按上述方法培养至所需代数，传代时在试管上注明菌种名称、菌种号、代数及传代日期等基本信息。
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