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- YBio/钰博生物
- YB757100-14
- 中国
- 2025年07月14日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
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大量
- 英文名：
Wolbachia spp. SYBR qPCR Kit
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海钰博生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
50次
Wolbachia spp. SYBR qPCR Kit
巴克氏菌(Wolbachia spp.)为革兰氏阴性菌，又称为沃尔巴克氏体，属
于变形菌纲 Proteobacteria 的 α 亚门，立克次氏体科乌巴克体族乌巴克体属中
的一种，1924 年由 Hertig 和 Wolbach 在尖音库蚊 Culexpipiens 的生殖组织
里首次被发现。沃尔巴克氏菌是自然界分布最为广泛的一种共生菌，在鞘翅目、
双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、直翅目和啮目等 10 多个目的 150
万一 500 万种昆虫中都有共生。沃尔巴克氏菌感染昆虫和其它节肢动物后，会导
致昆虫和其他节肢动物无法产生雄性后代。21 世纪初，对沃尔巴克氏菌的研究
成为热点。科学家们在积极寻找控制沃尔巴克氏菌的新方法或开发消灭沃尔巴克
氏菌的新药物，原因在于一旦控制或消灭沃尔巴克氏菌则有可能消除或抑制病原
性宿主对人类、禽畜和作物造成的伤害。因此快速检测沃尔巴克氏菌具有重要意
义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定
量 PCR 技术为基础开发的专门检测沃尔巴克氏菌的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 特异性高，引物是根据人沃尔巴克氏菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌和
微生物。
3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。
6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的 PCR。
| 编号 | 成分 | 规格 |
| 试剂一 | 2×qPCR MagicMix | 500 μL（棕色管） |
| 试剂二 | 荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
| 试剂三 | 沃尔巴克氏菌通用PCR 引物混合液 | 100 μL（白盖） |
| 试剂四 | 沃尔巴克氏菌通用PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) | 50 μL（黄盖） |
| 试剂五 | 天净沙核酸释放剂试用装 | 20 次（1mL，绿盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，
本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，
下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震
荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所
得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所
得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性
对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的标准曲
线样品的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或
第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定
量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为
NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA 提取试剂
盒兼容。
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个 样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则 反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | PCR阳性对照管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix （棕色管） |
10μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 沃尔巴克氏菌通用PCR引物混合液（白盖） | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 待测样品 cDNA 模板 | 6 μL | - | - |
| 第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液（2-7 号） |
- | - | 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
四、荧光定量 PCR 反应参数
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 942℃ | 5 min |
PCR 反应 （30 个循环） |
94℃ | 0.5 min |
| 506℃ | 0.5 min（采集 SYBR 通道的 荧光信号） |
|
| 72℃ | 0.5 min | |
| 最后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、数据处理
12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待
测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓
度。
六、电泳检测
13. 如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp。
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文献和实验所特有的，下游引物为通用引物就可以了。 荧光定量PCR检测方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于MGB探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐。 探针设计位置有3个：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉点、完全在RT引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。 四、试验操作流程
杆菌、寄生虫病等在内的数十种荧光定量PCR试剂盒，购买方便，价格便宜，并获得了国家相关认证。 值得一提的是鉴于当前流行病的频发以及实时荧光定量PCR技术的实际应用，国内外已将实时荧光定量PCR检测技术强制应用于相关行业并相继制定了国际、国家、及行业标准作为法律依据。例如： SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 荧光PCR方法 GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT
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