4、准备样品:取0.2~0.5g 植物须根系,洗净,用滤纸吸干,完全浸没于TTCAssay buffer工作液中,37℃避光孵育1~3h,加入2mlTTC 终止液终止反应。同时做一空白对照实验,即根系先完全浸没于2mlTTC 终止液以杀死根样,再加入10mlTTCAssay buffer工作液,37℃避光孵育1~3h。
5、提取:分别将上述实验组和空白对照组的根系取出,滤纸吸干水分,放入研钵或匀浆器中,加入3~4ml 乙酸乙酯,充分研磨或匀浆,以提取出TTF。把红色提取液(TTF)转移至离心管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2~3 次,再将洗涤液一并转移至离心管,最后补加乙酸乙酯至10ml,摇匀。
6、测定:比色杯光径1.0cm,系列标准管以“0”号管调零,测定1~5 号管485nm 的吸光度值;样品管以空白对照组样品提取液做参比,调零,以分光光度计或酶标仪测定实验组样品提取液在485nm 的吸光度值。
计算:以系列标准溶液TTF 含量(25、50、100、150、200ug)为横坐标,以对应吸光度为纵坐标,绘制TTF 标准曲线,根据回归方程计算待测样品的TTF 含量或TTC 还原量(μg),即为根系活力或脱氢酶活性。
根系(脱氢酶)活力[mg/(g.h)]=m/(1000×W×t)
式中:m=根据标准曲线查得的样品提取液TTF 含量(μg)= TTC 还原量(μg) W=植物须根系的重量(g)t=孵育时间(h)
注意事项:
1、 配制好的 TTC 溶液(0.4%)和 TTC Assay buffer 工作液应避光保存,若变红应弃用。
2、 根系种类不同,取样量可有不同。
3、 根系应吸干水分但不能挤压伤及细胞,才能测定准确。
4、 提取用的研钵或匀浆器、试管、比色皿均应保持干燥,没有水分。
5、由于本实验采用有机溶剂(乙酸乙酯)提取TTF,因此不能用一次性塑料比色皿或者酶标条进行检测。建议用石英比色皿或玻璃比色皿检测,检测完成后用乙醇清洗并用水冲洗干燥即可。
6、 如果没有分光光度计,也可以使用酶标仪测定,但应注意酶标板每孔检测体积。
7、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
附录:参考标准曲线范围:测定空白对照,通过分光光度计测定其吸光度多在0.03-0.07 之间。 测定TTF 标准在25、50、100、150、200、400μg 时吸光度,据此 作出其标准曲线如下:
注意:由于检测仪器和操作手法等条件的不同,参考值范围会有波动,该值仅供参考, 对于要求精确计算植物根系含量的,可以采用标准曲线多点重复测定;根据 测定经验显示,TTF 含量在 5μg 以下, 400μg 以上,标准曲线会有偏差。
有效期:12 个月有效。