Cell Meter Beta-Arrestin蛋白质易位G

简要概述

所有G蛋白偶联受体（GPCR）在通过配体结合激活后，都会通过一条共同途径迅速发生脱敏作用。 β-arrestin（一种细胞质蛋白）与激活的受体的结合使GPCR信号失活，并启动了受体向细胞内的易位，在此细胞中配体被去除，受体被循环回到细胞膜。通过将荧光标记（例如GFP）附着到β-arrestin，可以检测受体arrestin复合物的位置。由于脱敏仅发生在激活的受体上，因此检测β-arrestin的易位和随后的受体再循环提供了检测GPCR靶标激活的可靠方法。 Cell Meter Beta-Arrestin蛋白易位GPCR信号试剂盒提供了功能强大的功能分析，可通过荧光成像筛选目标化合物针对已知或孤立GPCR靶标的活性。靶向GPCR的激活诱导荧光向细胞膜和内吞囊泡的移位。

 

适用仪器

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荧光显微镜
激发：	FITC滤波片
发射：	FITC滤波片
推荐孔板：	黑色透明底板

产品说明书

样品实验方案

概述

准备细胞进行转染
准备Transfectamine 5000-DNA混合物
将Transfectamine 5000-DNA混合物添加到细胞培养物中，并孵育过夜
转染后24-30小时将转染的细胞转移到96孔板中，并将培养物孵育过夜
在荧光显微镜下分析由GPCR激活引起的转运

 

细胞准备

细胞密度在转染时它们将达到约60-70％的融合度。
转染前用新鲜的生长培养基替换。
注意：例如，对于6孔板，每孔替换为2 mL培养基，对于10 cm板，则替换为6 mL培养基。

 

储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免重复冻融循环。

β-arrestin-GFPDNA储备溶液
向小瓶β-arrestin-GFPDNA（组分A）中加入10 µL ddH2O，充分混合至终浓度为1 µg / µL。

 

操作步骤

1.将3 µg DNA（例如1.5 µg Beta-arrestin-GFP DNA储备液和1.5 µg您准备的GPCR DNA）与200 µL无血清培养基混合。
2.向混合物中加入9 µL Transfectamine 5000（组分B）。
3.充分混合并在室温下孵育20分钟。
注意：Transfectamine 5000和DNA的比例需要针对不同的细胞系进行优化，通常，在我们的测试中，Transfectamine 5000转染试剂（µL）与DNA（µg）的比例应为3-5 µL：1ug。

表1. 6孔板和10 cm板的样本表

	6孔板（每孔）	10cm板
新鲜培养基	2 mL	6 mL
质粒	3 µg	10 µg
无血清培养基	200 µL	600 µL
Transfectamine 5000转染试剂	~9 µL	~30 µL

 

转染和转运方案
1.将Transfectamine 5000 -DNA混合物添加到培养板中，并孵育过夜。
注意事项：最早在转染后16小时即可检测到重组蛋白。转染后72〜96小时可观察到最大表达水平。
2.转染后24-30小时将转染的细胞转移到96孔板中，并孵育过夜。
使用FITC滤光片（Ex / Em = 488/530 nm）在荧光显微镜下检测受体激活诱导的β-arrestin易位。

 

图示

图1. HeLa细胞中β-arrestin的易位。 HeLa细胞用β-arrestin-GFP和加压素受体2（V2R）瞬时转染。 HeLa细胞在6孔板中培养，并融合至〜60％。用9 µL Transfectamine 5000转染等量的β-arrestin-GFP（1.5 µg）和V2R质粒（1.5 µg）。转染后约30小时，将细胞转移到96孔板中。转染后约48小时，将加压素（1 µM）加入细胞中以诱导β-arrestin-GFP易位。使用FITC通道在荧光显微镜下加压素处理之前和之后2小时拍摄图像。