上海电泳PCR实验

一、电泳与PCR的协同原理

1. PCR技术原理
   PCR通过变性（94-98℃使DNA双链分离）、退火（50-65℃引物与模板结合）、延伸（72℃合成新链）三个步骤循环扩增目标DNA。经过25-30个循环，目标片段可被扩增数百万倍。其核心依赖于热稳定的Taq DNA聚合酶和特异性引物。

2. 电泳技术原理
   电泳利用电场中带电分子（如DNA带负电）的迁移速率差异进行分离。迁移速率与分子大小、电荷量及凝胶孔径相关。琼脂糖凝胶电泳是PCR产物分析的主要方法，溴化乙锭（EB）等染料嵌入DNA双链后可显色。

3. 协同作用
   PCR扩增后需通过电泳验证产物是否为目标片段。若扩增成功，电泳图谱会显示与预期分子量相符的清晰条带；若失败或存在非特异性扩增，则可能出现多条带、弥散带或无条带。

二、电泳PCR实验标准操作流程

1. DNA提取

   • 样本处理：取组织块（50-100 mg）液氮研磨成粉末，加入Trizol裂解细胞，通过氯仿分层、异丙醇沉淀、乙醇洗涤去除杂质，最终用DEPC水溶解RNA或DNA。
   • 质量控制：通过分光光度计检测A260/A280比值（1.8-2.0为佳），并通过RNA电泳观察18S和28S rRNA条带。

2. PCR反应体系配置

   • 试剂组成：包括10×PCR缓冲液、25 mM MgCl₂（终浓度1.5-2.5 mM）、dNTPs（终浓度0.2 mM）、上下游引物（各0.2-1 μM）、Taq酶（1-2 U/反应）、模板DNA（1-100 ng）及ddH₂O补至终体积。
   • 程序设置：

• 预变性：94℃ 2-5分钟；
• 循环阶段：变性（94℃ 30-60秒）、退火（温度依引物Tm值调整）、延伸（72℃ 1分钟/kb）；
• 终延伸：72℃ 5-10分钟确保产物完整性。

1. 琼脂糖凝胶电泳
   • 制胶：

• 配制0.5×TBE缓冲液，溶解琼脂糖（浓度1-2%），微波加热后冷却至60℃加入EB（终浓度0.5 μg/mL）或替代染料（如GelRed）。
• 倒入制胶板并插入梳子，凝固后置于电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液覆盖凝胶。
  • 上样与电泳：
• 取PCR产物（5-10 μL）与上样缓冲液（含溴酚蓝）混合，点样至胶孔，同时加入DNA分子量标记（Marker）。
• 设置电压（5 V/cm胶长度），电泳至溴酚蓝迁移至胶体2/3处停止。
  • 观察与分析：紫外灯下观察DNA条带，通过Marker对比判断目标片段大小。

三、电泳在PCR实验中的核心作用

1. 扩增产物验证：确认目标片段是否成功扩增及特异性，排除非特异性产物（如引物二聚体）。
2. 产物纯度评估：通过条带锐利度判断是否存在降解（如拖尾现象）或污染（如杂带）。
3. 定量分析：结合Marker粗略估计产物浓度，优化后续实验（如克隆、测序）。
4. 流程质量控制：通过阴性对照（无模板）和阳性对照（已知模板）排除假阳性或假阴性结果。