人IL-6 ELISA 试剂盒

本试剂盒采用定量双抗夹心ELISA分析技术，将抗人IL-6单克隆抗体预先包被在酶标板上，之后将标准品和分析样品加入到微孔中，样品中IL-6抗原会被预包被的抗体捕获，清洗掉未结合的物质后，将生物素标记的抗人IL-6单克隆抗体加入到微孔中反应，形成夹心复合物，再加入HRP酶标记的亲和素，清洗掉未结合的抗体及酶试剂之后，将显色底物溶液添加到微孔中显色，显色强度与样品中IL-6浓度成正比。

用于测定细胞培养上清液、血清和血浆中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。

所需设备及试剂
• 450 nm滤光片酶标仪，含540 nm或570nm校正波长更佳
•单道或多道微量移液器，移液器枪头
•去离子水
• 500 mL量筒
•样品稀释管或不同规格EP管
•吸水纸
 
  样品收集和储存
1） 细胞培养上清液：1000x g离心15分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。
2） 血清样本：全血室温放置60分钟或4℃过夜，然后1000 x g离心15分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。
3） 血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆，样品采集后30分钟内1000 x g离心15分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。
 
试剂准备
使用前将所有试剂和标本置于室温平衡。

1. 浓缩清洗液: 如果浓缩液中有晶体析出，加热至室温并轻轻混合，直到晶体完全溶解，25mL浓缩清洗液使用离子水定容至500mL，得到清洗工作液。
2. 用0.5ml标准品稀释液溶解IL-6标准品冻干粉，溶解后标准品母液浓度为1600pg/mL。震荡混匀后静置10分钟，用移液枪取100μL 标准品母液至EP管中, 再取700μL标准品稀释液至EP管中，得到第一个标准点200pg/mL，依次进行倍比稀释操作得到共计7个标准点200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.125pg/mL最后再以100ul标准品稀释液为零标准（0 pg/mL），共计8个标准点，建议每个标准点至少做2个平行孔。
3. 检测溶液A（生物素标记），使用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液1:100稀释至工作浓度。
4. 检测溶液B（HRP标记），使用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，临用前取合适体积用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。
5. 显色液: 避光保存，显色时100μL /孔。 
6. 终止液：显色完毕后50μL /孔。

使用前将所有试剂和样品置于室温。建议对所有标准品、对照品和样品进行一式两份的分析。
1. 按照前面章节的指示准备所有试剂和准备工作。 
2. 从板架上取下多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包的箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。
3. 每孔加入100μL标准品或样品，用封板膜封住，37℃孵育60分钟。
4. 弃去孔内液体，每孔加入 300μL的清洗液清洗，轻微震荡后弃去孔内液体，将酶标板倒扣在吸水纸上轻拍，使残留在孔内的液体全部去除，重复洗板 3 次，此过程也可采用尖嘴喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。
5. 每孔加入100μL检测溶液A（生物素标记），用新的封板膜封住，37℃孵育30分钟。
6. 重复步骤4中的洗板程序。
7. 每孔加入100μL检测溶液B（HRP标记），用新的封板膜封住。37℃孵育30分钟。
8. 重复步骤4中的洗板程序。
9. 每孔加入100μL显色液，37℃避光显色10分钟。
10. 每孔加入50μL终止液，孔里的颜色应该由蓝色变至黄色，如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀，轻轻震动酶标板板使颜色均一。
11. 擦干酶标板底部水气，立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度值（O.D.值），如果波长校正可用，则设置为540 nm或570 nm，如果波长校正不可用，则从450 nm的读数中减去540 nm或570 nm的读数，这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差，如果没有校正波长，可直接读取450 nm的读数，但读值有可能会更高、更不准确。

标准曲线制作 
每个标准品和样品的复孔平均值O.D.，减去零标准孔平均值O.D.后，以标准品的浓度为纵坐标，O.D.值为横坐标，绘出标准曲线（R²值越趋近于1曲线越精确），然后再将样品的平均值O.D.带入标准曲线的回归方程式，计算出样品浓度。
如果样品已经稀释，从标准曲线上算出的浓度须乘以稀释系数，即为样品的实际浓度。
 
标曲案例
标准曲线仅用于演示， 每次实验均需生成单独的标准曲线。

检测范围
3.125pg/mL—200pg/mL
 
最低检测限(MDD)
0.5pg/mL
MDD是测试20个零标准（稀释液）的平均O.D.值上加两倍标准差后计算相应的浓度来确定的。
 
精密度
批内差： CV<12%
批间差： CV<15%
 
稳定性
试剂盒按推荐温度保存6个月，信号强度降低小于 10%。

回收率
分别于培养基，血清和血浆样本中加入低，中，高浓度的 IL6标准品，测定值与理论值的比率即为回收率。

线性
分别于培养基，血清和血浆样本中加入一定量的 IL6标准品，使用稀释液倍比稀释成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待测样本，稀释后样本中 IL6 含量的测定值与理论值的比率即为线性范围。

实验细节说明
1. 在试剂盒标签上的有效期内使用，不要与其他厂家的试剂盒混合使用。
2. 如果样品检测值超出标准曲线范围，可使用适当的稀释液稀释样品并重新测定，或预估样品中IL6浓度，在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。
3. 为避免交叉污染，不同标准品、样品、试剂的加样需更换移液枪头，每管试剂使用单独的容器储存。
4. 在孵育过程中贴紧封板膜。
5. 显色液避光保存，临用前15分钟从冰箱取出在室温平衡。
6. 浓缩清洗液（20×）需使用去离子水1：20稀释至工作浓度，去离子水不包含在试剂盒中，需实验人员自备。
7. 终止液为酸性溶液，具有轻微腐蚀性，使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接触，使用大量清水冲洗后观察接触部位反应，如情节严重请及时就医。
8. 试剂盒酶标板条可按需拆卸使用，已开封的试剂盒建议在1个月内使用，未开封的试剂盒以包装盒上保质期为准。

 

普健生物（武汉）科技有限公司于2012年在武汉成立，作为武汉国家生物产业基地指定的光谷抗体发现与筛选公共服务平台，具备优越的技术实力和国际化发展的战略格局，专注于重组蛋白、抗体、诊断原料、抗体药物发现等自主技术平台的建设和下游生物医药产品的战略合作。

公司大楼坐落于东湖新技术开发区神墩四路, 这里绿叶繁茂，道路宽敞，周围有一众生物科技型高新企业。普健生物作为一员加入此处，为周遭增添了一抹亮丽的色彩。

公司立足于生命科学领域，自主建立三大完善的技术服务平台：生命科学研究平台、诊断原料开发平台、抗体药物研发平台。生命科学平台：拥有五大成熟高效的蛋白表达系统（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞），鼠/兔单克隆抗体平台，可提供蛋白表达、分子构建-蛋白表达纯化-结构解析、抗体重组表达、鼠/兔单克隆抗体制备以及相关检测服务。诊断原料开发平台：拥有开放式化学发光自动平台，可缩短研发周期、降低开发成本与技术风险，为广大客户提供各种诊断核心原料开发。抗体药物发现平台以杂交瘤筛选与噬菌体展示技术为主，目前已完成构建并对外提供抗体筛选技术服务的文库有：新冠特异性抗体噬菌体文库、羊驼天然纳米抗体噬菌体文库、兔源天然抗体噬菌体文库、小鼠天然抗体噬菌体文库。同时也开发了大量的重组蛋白、抗体、工具酶、药物对照抗体、工业酶、诊断原料等相关产品。

目前已拥有的自主技术包括：哺乳动物细胞重组蛋白表达系统、稳定细胞株构建、噬菌体文库的构建以及淘选、DNA免疫技术、化学发光免疫诊断抗体筛选技术等等。截止目前已成功交付数万例与重组蛋白、抗体相关的技术委托研发，客户以及合作伙伴涵盖了国内外优秀的学术研究机构以及制药公司；并且与FIND（创新诊断基金会）、BAYER（拜耳作物科学）、广州呼吸健康研究院建立合作关系；与青岛大学附属医院医学研究转化中心，苏州系统医学研究所，广州再生医学与健康广东省实验室建立战略合作关系。