引物合成/实验基地/快速交付/质量可靠/纯化方式可选/引物标

引物合成

【服务介绍】
引物合成采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

【服务特色】

• 实验基地：全国多个城市都有实验基地，近距离的提供服务。
• 快速交付：常规引物当日下单，次日送达（仅满足有实验基地的城市）。
• 质量可靠：严格的质控，所有修饰引物全部采用HPLC纯化。
• 纯化方式可选：可提供OPC(脱盐)、PAGE、HPLC纯化，满足各种实验需求。
• 引物标记：提供各种化学修饰碱基、生物素、荧光标记等（详见修饰引物）。

（一）普通引物合成

常规引物：6-59 mer

长链引物：60-150 mer

纯化方式选择：

收费方式：

【服务说明】

• 未注明合成量，我们将按照总量2 OD，分装2管合成。
•  兼并碱基按照常规引物收费。
• 引物＜15 mer的按条收费，引物＞59 mer的按长链收费。
• 修饰引物价格计算方式：总价=常规引物的价格+修饰价格。
• 如需周末送货，请与当地销售联系。
• 兼并引物对应：R=G+A 、Y=C+T 、K=G+T 、W=A+T 、S=C+G 、M=A+C 、B=C+G+T 、D=A+G+T 、H=A+C+T 、 V=A+C+G 、N=A+C+G+T

（二）修饰引物合成

我们可以合成所有常见的修饰引物。我们合成的修饰引物全部采用HPLC纯化，确保引物序列准确性和更好的纯度。修饰引物的HPLC纯化不收取纯化费用。

修饰引物的价格=普通DNA 合成价格+修饰价格。

 双标记引物合成： 

【引物常见问题】

Q-1、合成DNA溶液在室温下放置了数天，还可以使用吗?

A-1.溶液中的Oligo DNA常温下数天（3-4天）应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命受溶液中的菌体、核酸酶等的影响。

Q-2、怎样理解测定的OD值?

A-2.进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测定200 ml溶液中的OD值为1.5时，溶液整体的OD量应该为多少？此时的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD。

Q-3、怎样对合成的DNA制品进行定量?

A-3. DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的。1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。

Q-4、合成Oligo DNA应怎样保存?

A-4.保存合成的Oligo应该注意以下几点： 

(1).干燥制品很稳定，常温下数个月无问题。但为保证万无一失，放置于-20℃保存为好。 

(2).溶解后的溶液DNA短期内（1-2周）使用可放置在4℃下保存，长期保存请放置于-20℃。溶解DNA时，请注意使用无菌、无核酸酶的水或TE Buffer。

(3).荧光标记引物请避光保存。

Q-5、制品溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗?

A-5.所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用C18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。

Q-6、为什么PAGE级和高纯度级制品的提供量比其他公司少?  

A-6.无论是PAGE纯化，还是HPLC纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在2 OD左右。大OD量的提供对提高纯度是不现实，不科学的做法。一般，1 OD的20mer的DNA制品 (约5 nmol)，可以进行200-400 次的PCR反应 (50ml体系)，以及1,400次的测序反应。因此，2 OD 的DNA量可以足够进行一般的实验工作。

Q-7、我公司的DNA制品包装中为什么不提供电泳照片? 

A-7.进行过Oligo DNA PAGE电泳的人员都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品电泳时的泳带亮度（清晰度）是不一样的。原因在于EB等染色剂的染色是渗透至DNA的双链之间的，而合成的Oligo DNA是单链，Oligo DNA自身形成的立体结构越复杂，EB的染色就越容易，DNA带也就越亮。相反，有一些Oligo DNA由于不形成立体结构，根本就不为EB所染色。因此，我们认为有些公司对所有产品都提供差不多同一亮度的制品的电泳照片是非常不现实的做法。

Q-8、使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品，发现有很多条泳带，为什么?

A-8.Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带（更无法用Agarose电泳进行定量了)。

Q-9、进行PAGE电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

A-8.Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带（更无法用Agarose电泳进行定量了)。

(1). A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；

(2). DNA的立体结构不同，电泳速度不同。这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。

Q-10、PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，为什么?

(1). 合成机管路的瞬时阻堵，造成化学反应的瞬间中断，其结果可能会发生单个(或一部分)碱基的缺失。

(2). 计算机程序失灵，控制错误合成。

(3). 合成过程中，碱基附加至DNA片段之前，碱基和碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，造成多碱基现象。

(4). 合成时碱基G可能会转化成烯醇异构体，此时进行PCR反应时G会转变成A。

(5). 合成过程中的脱嘌呤作用，对脱嘌呤后的碱基DNA聚合酶不能识别，此时可能观察到A或G的缺失。嘌呤含量越高，就越容易发生这种情况。

(6). 不完全的脱保护结果。通常C脱得快，G脱得慢。不完全脱保护会发生碱基缺失。

(7). 合成过程中的Capping（盖帽）反应不完全，使短片段DNA继续参与合成，造成碱基缺失。 应该说，上述这些情况发生的可能性都极低。然而，合成的DNA链越长，发生这种情况的机率也就越大。

Q-11、PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?

A-11.(1). 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，也许结果会变好。

(2). 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。

Q-12、进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办? 

A-12.(1). 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证，这是实验的常识。

(2). 我们可以免费重新合成引物。

(3). 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。

Q-13、怎样才能保证Oligo DNA的正确性? 

A-13.(1). 合成Oligo DNA时，选用高纯度级制品。

(2). 避免使用大于50mer的长链Oligo DNA，最好选用小于35mer的合成DNA制品。

(3). 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。

Q-14、Oligo DNA最长可以合成多少个碱基? 

A-14.以每步反应效率为99%进行计算，粗略计算合成到100个碱基时，目的DNA片段的比例便为0 (精确数为37.0%)，要想保证合成DNA的碱基100%正确，Oligo DNA的长度最好不要超过70mer，80mer以上要想保证一个碱基不错就非常危险了，须十分注意。

Q-15、一般的合成Oligo DNA的5'和3'末端有Q吗? (Q为修饰) 

A-15.没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加Q，订货时请特别注明，此时需收取加Q (Q修饰) 的费用。

Q-16、合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?

A-16.PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。

(1). 引物和模板是否配对，同源性有多大?

(2). 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构?

(3). PCR反应用试剂是否能正常工作?

(4). PCR仪是否工作正常?

(5). PCR反应条件是否合适?

【公司简介】
北京擎科生物科技有限公司（Tsingke Biotechnology Co., Ltd.）是一家合成生物学国家高新技术企业，从事合成基因组学与生物合成产品的研究及开发。业务范围涵盖合成基因组学产品及服务、生命科学研究设备及原料、生物制造CRO/CDMO三大方向。   
公司总部位于北京，运营实体和实验室遍布全国，业务覆盖中国并延伸至美国、德国等多个海外国家，为全球约12万用户提供服务与产品。截至2021年03月，公司现有员工1400名，拥有97项专利及核心技术，其中超40项为发明专利。使用擎科生物服务和产品客户发表文章累计超过3419篇，影响因子累计达到11488.6。



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