人疱疹病毒6B型探针法荧光定量PCR试剂盒

人疱疹病毒6B型探针法荧光定量PCR试剂盒    

Human Herpesvirus-6B(HHV-6B)

产品及特点

人疱疹病毒 6 型，属疱疹病毒科β亚科，为 1986 年从淋巴增生性疾病和艾 滋病患者淋巴细胞中培养获得的一种新病毒。该病毒具有典型的疱疹病毒的形态 学特征，但其基因结构和抗原性与其他已知的 5 种疱疹病毒不同，因为分类为 HHV-6。HHV-6 为嗜淋巴细胞病毒，可在 T 型及 B 型淋巴细胞内复制。根据抗 原性不同，又可将 HHV-6 分为 A、B 两组，两组病毒间的基因同源性达 96%以 上，但两型间的抗原性和致病性等方面略有不同。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测人疱疹病毒 6B 型的试剂盒，它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据人疱疹病毒6B 型高度保守区设计，不会跟其他病毒的 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。

人疱疹病毒6B型探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	人疱疹病毒 6B 型探针法 qPCR 引物 混合液	100 μL（白盖）
试剂四	人疱疹病毒 6B 型 qPCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂五	人疱疹病毒 6B 型探针法 qPCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂  样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
人疱疹病毒 6B 型 qPCR 探针	2 μL	2 μL	各2 μL
人疱疹病毒 6B 型探针法 qPCR 引物 混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	7 μL	不加	不加
超纯水		7 μL
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各7 μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 min
PCR反应 （40个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号）

 

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！