隐孢子虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒

隐孢子虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒

Cryptosporidium spp.

产品及特点

隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）为体积微小的球虫类寄生虫,广泛存在多种脊椎动物体内，寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫，由微小隐孢子虫引起的疾病称隐孢子虫病，是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病,会给人体健康带来严重损害，因此快速检测隐孢子虫具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测隐孢子虫的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据人隐孢子虫高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6.本产品只能用于科研。

隐孢子虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

 

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	隐孢子虫探针法 qPCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	隐孢子虫 qPCR 探 针	50 μL（棕色管）
试剂五	隐孢子虫探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷 贝/μL)	50 μL（红盖）
试剂六	天净沙核酸释放剂试用装	20次（1mL,绿盖）
试剂七	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂  DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
隐孢子虫qPCR探针	2 μL	2 μL	各2 μL
隐孢子虫探针法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2个待测DNA模板	6 μL	不加	不加
超纯水	不加	6 μL	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
隐孢子虫qPCR探针	2 μL	2 μL	各2 μL
隐孢子虫探针法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2个待测DNA模板	6 μL	不加	不加
超纯水	不加	6 μL	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应 （40个循环）	94℃	0.5 min
	55℃	0.5 min（采集FAM通道的荧光信号）
	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	min

 

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
五、数据处理
12.以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
六、电泳检测
13..如果有必要电泳确认，可取10-20 uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！