新生隐球菌探针法荧光定量PCR试剂盒

新生隐球菌探针法荧光定量PCR试剂盒

Cryptococcus neoformans

产品及特点

新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是深部感染真菌中隐球菌属的主 要菌种之一，种类较多，广泛分布于自然界，例如受动物污染的土壤，检出率较 高。由于肿瘤及化疗药物的使用、艾滋病的流行、移植术后免疫抑制药物的使用 等原因，新生隐球菌的发病率越来越高，在国外已成为艾滋病患者常见的并发症 之一，也是导致患者死亡的重要原因，在我国新生隐球菌的发病率也呈逐年增加 的趋势，因此快速检测新生隐球菌具有重要意义。荧光定量 PCR 是检测传染性 疾病的主流技术。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检 测新生隐球菌的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据新生隐球菌高度保守区设计，不会跟其他病原菌 DNA 发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6.本产品只能用于科研。

新生隐球菌探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

 

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	新生隐球菌探针法 qPCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	新生隐球菌 qPCR 探 针	50 μL（棕色管）
试剂五	新生隐球菌探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷 贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂  DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
新生隐球菌 qPCR 探针	1 μL	1 μL	各2 μL
新生隐球菌探针法 qPCR 引物混合液）	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	7 μL	不加	不加
超纯水		7 μL
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各7 μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应 （40个循环）	95℃	15sec
	60℃	60sec（采集 FAM 通道的荧光 信号）

 

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！