双歧杆菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

双歧杆菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

Bifidobacterium spp.

产品及特点

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类存在于人体中非常重要的专性厌氧菌， 于 1899 年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离，研究证实双歧杆菌具 有平衡肠道菌群、降胆固醇、延缓衰老及抗肿瘤等生理功能，是人体益生菌群的 主要组成。添加双歧杆菌的微生态制剂开发研究已成为一大热点，广泛应用于食 品、保健和医疗等领域。但不断有报道指出国内外市场上双歧杆菌微生态制剂标 示名称混乱，很多国家市场上双歧杆菌制品假冒代替现象严重。本产品就是以探 针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测双歧杆菌属的通用试剂盒，它具 有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据双歧杆菌属高度保守区设计，不会跟其他病原菌 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

双歧杆菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（亮黄盖）
试剂三	双歧杆菌属通用探针法 qPCR 引 物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	双歧杆菌属通用 qPCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂五	双歧杆菌属通用探针法 qPCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。 

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，用带芯枪 头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）： 

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	标准曲线 样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
双歧杆菌属通用 qPCR 探针	1 μL	1 μL	各 1 μL
双歧杆菌属通用探针法 qPCR 引 物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板	7 μL
超纯水		7 μL
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号）			各 7 μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
qRT-PCR 反应 （40 个循环）	95℃	15sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧光 信号）

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值 小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！