G-418(Geneticin)

中文名:G-418(Geneticin)

英文名:G-418(Geneticin)

CAS:108321-42-2

级别:USP Grade

分子量:692.7

分子式:C20H40N4O10·2H2SO4

纯度:N/A

储存条件:2-8℃
产品简介

 G418 Sulfate（G418硫酸盐）也称作Geneticin（遗传霉素）是一种结构类似于庆大霉素B1(Gentamycin B1)  的氨基糖苷类抗生素，通过影响80S核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成，对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因（主要为neo基因）位于转座子Tn601（903）或Tn5（来源于细菌），但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞，使其获得对G418的耐药性，从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。

  哺乳动物细胞中，当抗性基因neo被整合进真核细胞基因组后，使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3)II）。此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能，抑制抗生素-核糖体间的相互作用，从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验，需要建立杀灭曲线（剂量反应曲线）确定杀死无抗性细胞的最低有效浓度。
植物细胞中，通过转染携带nptII基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶，这个酶使得多种抗生素丧失活性，包括G418，卡那霉素和巴龙霉素。
使用方法
1. G418储存液的配制（50 mg/mL，活性浓度）
1、活力单位的换算
根据公式换算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而异，可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
例如：G418活力值为：750 µg，要配制50 mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。如果配制10 mL的G418储存液（活性浓度，50 mg/mL），则需要称取663.3 mg粉末。
2、除菌和保存
根据上述换算得到的实际粉末称重，加入10 mL无菌去离子水内使其完全溶解。0.22 μm过滤，除菌后分装放到-20℃冻存，1年稳定。
注：不建议使用液体培养基、氯化钠溶液、磷酸盐溶液，或者有机溶剂来制备储存液。
2.常用筛选浓度
通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL。
刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，后续用较低浓度的G418维持培养。生长条件、细胞类型、环境因素都可能影响G418的用量，因此建议新建实验体系通过杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。
不同细胞类型使用G418筛选使用的浓度： 

细胞类型	激活浓度（μg/mL）	应用
网柄菌属	10	培养液培养
	30	冻干细菌培养
哺乳动物	400-1000	筛选
	200	维持生长
植物	25-50	筛选
	10	维持生长
酵母	500	筛选
	125-200	维持生长
细菌	8-16	筛选

3.杀灭曲线的建立

通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL。

为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。

1、按照20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上，37℃，CO2过夜培养（需要更高密度，可增加接种量）。

2、根据细胞类型，设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定50，100，250，500，750，1000μg/mL。

3、第2天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基，每个浓度做三个平行孔。

4、接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

5、按照每2天进行活细胞计数，来确定杀灭未转染细胞的恰当浓度。通常7-10天内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为筛选用的工作浓度。

稳定转染细胞的筛选

1、转染48 h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。

注：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密，其效率会降低，最好将细胞稀释至丰度低于25%。

2、每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。

3、筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。

4、挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

5、后续更换正常培养基培养即可。

注意事项

1、G418不可高压灭菌；

2、G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）共同使用，因为它们是G418的竞争性抑制剂。其它的抗生素会产生交叉活性。

3、配制G418溶液时，要换算不同批次G418的活力值（potency），从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。

4、加入G418的培养体系，未转染的细胞未被杀死，可能因为药物浓度过低，或者细胞密度过高。快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。添加抗生素5-7天后可能才会杀死对照细胞（未转染），转染细胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

5、加入致死剂量的G418，细胞可能还会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！