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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 供应商:
上海泽叶生物科技有限公司
- 库存:
18
- 英文名:
5×Hi TaqMan qPCR Mix
- 保质期:
1年
- 保存条件:
-20
- 规格:
100T/500T
5×Hi TaqMan qPCR Mix
| 5xHi TaqMan qPCR Mix是采用TaqMan探针法进行Real-Time PCR的专用试剂,适合于FAM/HEX/TET/JOE等双标记探针(本品也适用于Molecular Beacon探针),该预混液将化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP染料等试剂预混在一起,是一种5×浓度的单组分预混试剂,进行实验时,PCR反应液的配制十分方便简单,只需加入引物、探针、模板、水即可。 制品中的DNA聚合酶为化学法修饰的Hot Start Taq DNA 聚合酶,该酶在50度以下100%无活性,只有95度条件下加热15min后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性PCR扩增,极大的提高了PCR扩增特异性。该试剂盒独特的反应缓冲液,可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。 该制品配有单独的ROX内参染料,使得该试剂可应用于所有RealTime PCR机型,包括:ABI 7000/7700/7900HT, 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems);Mx3000P (Stratagene);LightCycler (Roche Diagnostics); Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad&MJ);Line-Gene(Bioer,杭州博日)等。 | |||||||||||
组分 |
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主要特征 |
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应用 |
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| RNA和microRNA的相对定量检测。 | |||||||||||
注意事项 |
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储存 |
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| 1、长期保存,请避光置于-20℃或-70℃可保存3年。 2、经常使用,融化后可置于4℃,可保存1年。 注:长期-20℃保存可能会出现沉淀,室温融化后混合均匀,不影响试剂性能。 |
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反应实例 |
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Fig:应用本试剂盒进行TaqMan探针法检测 10~107 copy模板的
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文献和实验一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用
几个复孔,选择重复性好的 CT 值参与计算。 (2)CT<30,重复性较差。这种情况一般同操作有关。 解决办法:从以下几个方面进行问题的排查:①加样准确度;②移液器吸取液体的准确度;③定期校准 qPCR 仪。 ①加样准确度 避免小体积加样,减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O 配置成混合体系,并且增加模板的稀释梯度,大体积加样。如:原液 cDNA 添加 1μl,可以更改为原液 cDNA 稀释 5 倍,添加 5μl,使用 ddH2O 补齐体系至 20μl 即可
装备很重要:做出心中的梦中情图,最基本的一步就是拥有一把好用的移液枪,保证其量程是准确的,且每次做 RT-qPCR 的时候要固定使用那一把移液枪,避免造成因枪的不同带来的误差。 保证 RNA 质量:A260/A280要在 2 左右;不同组的样品 cDNA 的浓度也要一致,只有这样你所要扩增的模板的基线才是一致的,后续出来的 CT 值才有参考意义。 反复确认引物种属:很多刚接触实验的小白们,拿着 human 的引物在鼠样本上做 RT-qPCR,,也许跑到天荒地老这个结果也无法得到,既浪费
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