phi29 DNA 聚合酶是从嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆出的嗜温(30℃)DNA聚合酶,它具有特殊的链置换和连续合成特性,可连续合成长达70kb的DNA片段。phi29 2.0 DNA 聚合酶是phi29 DNA聚合酶的改造体,并经多次纯化分离而得。在保留了phi29 DNA聚合酶的链置换、连续合成特性(>70kb)的基础上,提高了滚环扩增的反应温度,phi29 2.0 DNA 聚合酶可以在42℃条件下持续的进行DNA合成(而phi29 DNA 聚合酶在此温度下反应活性很低)。 这种高温的反应特性,具有以下优势:(1)在NGS测序中,其提升了高GC含量、回文结构等复杂模板的延伸能力,使得NGS的覆盖度更均一,降低测序所需深度;(2)高温的反应条件,提升了WGA产物的合成量(2-5倍),并缩短扩增时间(1~2h完成建库扩增);(3)降低测序中Gap区域,提升单细胞测序的数据质量和完整度;(4)降低非特异性扩增产物;(5)提升MDA/RCA等实验的扩增性能和特异性。 此外,该酶仍然具有很强的3’→5’外切酶校读功能,合成的DNA片段保真性高。该酶的外切酶活性较强,因此合成过程中引物需要3’端硫代修饰,以降低外切活性对引物的切割效应。
主要特征
超强链置换能力
连续合成能力
扩增的高保真性
应用
DNA恒温滚环扩增
需强链置换和DNA连续合成的反应
质粒快速复制
高保真快速复制
储存
-20℃可保存3年。
注意事项
1. 1×phi29 Buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.5,10 mM MgCl2,10 mM (NH4)2S04,4 mM DTT。必要时可单独额外添加终浓度1 mM DTT和0.2 mg/ml BSA,可提高反应效率。 2. 65℃ 10min即可使该酶失活。 3. 根据实验类型需要,调整dNTP的浓度100~500 μM。 4. 添加Yeast Pyrophosphatase(货号:C5006)可提高DNA产量。 5. 反应引物3’端的硫代修饰可避免引物降解。