样品实验方案
简要概述
1.准备GSH工作溶液(50μL)
2.添加GSH标准品或测试样品(50μL)
3.在室温下孵育10至60分钟
4.检测Ex / Em = 490/525 nm处的荧光增加(cut off= 515 nm)
溶液制备
1.储备溶液
1.1 GSH标准溶液(1 mM):
将200μL测定缓冲液(组分B)加入到GSH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol /μL)GSH标准溶液。
1.2 Thiolite Green原液(100X):
将100μLDMSO(组分D)加入到Thiolite Green(组分A)的小瓶中以制备100X Thiolite Green原液。
2.标准溶液
2.1醛标准溶液
将30μL的1mM(1nmol /μL)GSH标准溶液加入到970μL的测定缓冲液(组分B)中以产生30μM(30pmol /μL)GSH标准溶液。 取30μM(30 pmol /μL)GSH标准溶液,进行1:3连续稀释,得到用分析缓冲液(组分B)连续稀释的GSH标准品(SD7-SD1)。 注意:稀释的GSH标准溶液不稳定。 在4小时内使用。
3.工作溶液
将50μL 100XThiolite Green原液加入5 mL分析缓冲液(组分B)中,充分混合,制成GSH工作溶液。
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样品分析
表1.实心黑色96孔微孔板中GSH标准品和测试样品的布局。 SD = GSH标准品(SD1 - SD7,0.01至10μM); BL =空白对照; TS =测试样品
BL |
BL |
TS |
TS |
SD1 |
SD1 |
... |
... |
SD2 |
SD2 |
... |
... |
SD3 |
SD3 |
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SD4 |
SD4 |
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SD5 |
SD5 |
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SD6 |
SD6 |
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SD7 |
SD7 |
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表2.每个孔的试剂组成
孔 |
容积 |
试剂 |
SD1-SD7 |
50ul |
连续稀释液(0.01至10μM) |
BL |
50ul |
分析缓冲液 |
TS |
50ul |
测试样本 |
1.根据表1和2中提供的布局制备GSH标准品(SD),空白对照品(BL)和测试样品(TS)。对于384孔板,每孔使用25μL试剂代替50μL。 注意:根据需要处理细胞或组织样本。
2.在GSH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLGSH工作溶液,使总测定体积为100μL/孔。 对于384孔板,在每个孔中加入25μLGSH工作溶液,总体积为50μL/孔。
3.在室温下孵育反应10至60分钟,避光。
4.用荧光酶标仪在Ex / Em = 490 / 525nm(截止= 515nm)下检测荧光增加。