羊口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒

【产品名称】
通用名称：口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒
英文名称：Liquid-phase Blocking ELISA Kit for Detecting FMDV Type A Antibodies
【规格】96T×2块
【用途】
检测羊血清中的口蹄疫A型抗体，适用于动物疫苗免疫抗体监测。
【储藏与有效期】2～8℃保存，有效期12个月。
【主要组份】 

序号	组份名称	数量
1	FMDV-A抗原包被板	96T×2块
2	HRP-A型FMD单抗	12mL×1瓶
3	样品稀释液	20mL×1瓶
4	FMDV-A阴性对照	1.0mL×1管
5	FMDV-A阳性对照	1.0mL×1管
6	单组份TMB	12mL×1瓶
7	终止液	12mL×1瓶
8	浓缩洗涤液(20×)	20mL×1瓶
9	说明书	1份

 
【试验操作】
1、洗涤液配制 
将浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释成洗涤液(1×)，即1份浓缩洗涤液加入19份蒸馏水，配制的洗涤液(1×)作为洗板用。
 
2、定性检测方案(单孔定性，每板检测92份血清样本)
 
【操作步骤】
2.1加样:设阴性对照血清(A1B1)和阳性血清(C1D1)各2孔，直接加入50ul/孔对照血清；其它为被检样品孔，预先在相应孔内加入45ul的稀释液，接着加入5ul/孔待检血清；后，在所有孔内均加入50ul的HRP-O型FMD单抗，被检血清即为1：20稀释。振荡，混匀，37℃温育30分钟。
2.2TMB底物：用洗涤液洗板3遍，后一次拍干，加入TMB底物，50ul/孔，37℃温育15分钟。
2.3反应终止： 加入终止液，50ul/孔，终止反应。
2.4读值：酶标仪450nm波长读数。
 
【计算方法】
2.5阻断率计算
阴性对照平均值=（OD_-A1+OD_-B1）/2;
阳性对照平均值=（OD_+C1+OD_+D1）/2;
样品阻断率 PI=[（阴性对照平均值-样品OD值）/阴性对照平均值]×100%
根据以上公式计算被检样品和阳性对照样品的阻断率。
   2.6试验成立
    两孔阴性对照OD450nm值至少一孔OD值大于0.5；两孔阳性对照至少一孔的阻断率大于60%。
【结果判定】
被检样品PI≥50%判为口蹄疫病毒A型抗体阳性；PI＜50%判为口蹄疫病毒A型抗体阴性。
 
3、定量检测方案(每板检测10或20份血清样本)
 
在使用前，所有的试剂盒组份应恢复到室温。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。每个样品使用一个单独的吸头。
3.1样品稀释: 取出FMD－O抗原包被板，根据不同的需要，选择图1或图2中的一种布局进行操作。图1为可检测10份样品布局图；图2为可检测20份样品布局图。每次试验，每板均需设置阴阳性血清对照及4孔不加血清单抗对照。
以图1为例操作，A1～A10每孔各加75µL的稀释液，其它所有孔内各加入50µL的稀释液。A1～A10每孔各加25µL的待检样品，A11孔加50µL的阳性对照，A12孔加50µL的阴性对照，用排枪吹打混匀（每孔吹打3～5次），待检样品A1～A10分别以50µL/孔的量从A到H连续2倍稀释；阳性对照A11以50µL/孔的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照A12以50µL/孔的量从A到B连续2倍稀释。待检样品在第1～10列从1:4稀释至1:512；阳性对照，从1:2稀释至1:256，由于试剂盒提供的阳性对照已1:4稀释，则变为从1:8稀释至1:1024；阴性对照，从1:2稀释至1:4。
3.2 加入HRP－A型FMD单抗：样品稀释好后，在所有孔内加入50ul的HRP－A型FMD单抗，反应体系即为100µL/孔。加样完毕后，所有稀释度翻倍，待检样品从1:8～1:1024，阳性对照从1:16～1:2048，阴性对照从1:4～1:8，贴封板膜，振荡混匀。将加好样的ELISA反应板置于37℃温育30分钟。
3.3洗板：用230μL（±20μL）洗涤液(1×)洗涤板孔，共洗涤3次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。在后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液拍干。按50μL/孔加入TMB底物，37℃避光温育10～15min。
3.4读值： 每孔再加50μL终止液终止反应，立即在450nm波长下读取OD值。
 

图1  96孔板检测10份样品布局图

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

S1 1:8

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

1:16

1:4

B

1:16

1:32

1:8

C

1:32

1:64

空白

D

1:64

1:128

空白

E

1:128

1:256

不加血清单抗 对照

F

1:256

1:512

G

1:512

1:1024

H

1:1024

1:2048

 

图2  96孔板检测20份样品布局图

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

S1 1:16

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

1:16

1:4

B

1:32

1:32

1:8

C

1:64

1:64

空白

D

1:128

1:128

空白

E

S11 1:16

S12

S13

S14

S15

S16

S17

S18

S19

S20

1:256

不加血清单抗 对照

F

1:32

1:512

G

1:64

1:1024

H

1:128

1:2048

 
 
【结果分析】
3.5试验成立判断
不加血清单抗对照OD值应在2.0±1.2范围内；
阳性对照抗体效价不低于1:1024±1滴度；
阴性对照抗体效价应＜1:8。
3.6结果判定
不加血清单抗对照4孔，弃去高和低OD值，计算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即得50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50％反应的对照OD值。待检样品OD值＞临界值，判为阴性孔；待检样品OD值≤临界值，判为阳性孔。每份待检样品系列梯度稀释中，阳性孔的高稀释倍数即为该待检样品的抗体效价。若临界值处于两个稀释孔OD值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。如临界值处于1:64（反对数值为1.8）与1:128（反对数值为2.1）之间，则判定该份待检样品的抗体效价为1:90（反对数值为1.95）。
抗体效价≥64，为疫苗免疫合格。
抗体效价计算对照表（反对数值）

抗体效价	Log10(效价) 对照计算	抗体效价	Log10(效价) 对照计算	抗体效价	Log10(效价) 对照计算
1:4	0.6	1:32	1.5	1:256	2.4
1:6	0.75	1:45	1.65	1:360	2.55
1:8	0.9	1:64	1.8	1:512	2.7
1:11	1.05	1:90	1.95	1:720	2.85
1:16	1.2	1:128	2.1	1:1024	3
1:22	1.35	1:180	2.25	1:1440	3.15

 
 
4、注意事项
4.1 为使您的实验获得正确结果，请您在实验前仔细阅读本说明书。
4.2 所有试剂使用前恢复至室温(18～26℃)，以免温度过低影响抗原抗体反应。
4.3实验前应用温度计检查温箱温度，温度过高或过低影响OD值高低。
4.4 包被板反应时严禁堆叠放置，应该平铺且板间有空隙，不要离温箱壁太近。
4.5实验所用移液器及设备应定期校准。
4.6采集的样品要新鲜，并且好不要溶血。血清标本在2～8℃放置不要超过2天，室温不超过8小时，如需长时间放置应储存于-20℃。