细胞在组织样本中相对的位置关系对于理解疾病病理学至关重要。Visium空间基因表达解决方案不仅可以检测带有空间分辨的全转录组表达,同时还可以捕获相同组织切片中的组织学信息,并且可以将基因表达谱映射回组织原始的位置。该解决方案为癌症,免疫生 理学,神经科学,发育生物学等领域的研究提供组织和基因表达复杂性的新视角。
Visium空间基因表达解决方案主要原理
用于文库构建的每张载玻片上有四个捕获区域(6.5x6.5mm),每个捕获区域含有5000个被条形码标记的点(barcoded spots), 直径为55 μm,(两点之间中心的距离为100 μm),每个点都有一个独特的条形码序列。当RNA从组织切片的细胞中释放出来后,迁 移到每个点的RNA会被标记上相应的条形码序列,然后进行文库构建并进行测序。接下来,根据数据的条形码信息对数据进行分配, 以确定哪些数据来自哪个位置。最终实现空间基因表达的可视化。
Visium空间基因表达解决方案工作流程
Visium空间基因表达解决方案研究领域
Visium空间基因表达解决方案技术优势
- 将空间分辨的全转录组分析与形态学背景相结合,补充单细胞基因表达在空间信息上的空白
- 通过绘制所有基因活动发生的位置,获得疾病复杂性的完整视图
- 通过无偏分析发现新的目标
Visium空间基因表达解决方案结果展示
A.对小鼠大脑切片进行H&E染色,成像,然后通过10x Genomics公司Visium空间基因表达解决方案工作流程进行处理;B.展示了含有 UMI计数的数据与组织空间位置的图像叠加;C.总基因计数;D.基于总差异表达基因的空间naÏve聚类(spatially naÏve clustering)。 最右边显示了相比于其他细胞簇,在细胞簇4(绿色)中高表达的基因。
A.H&E染色小鼠冠状脑组织切片;基因 Selenow(B)和基因 Tmsb4x(C)的空间mRNA表达为大脑中已知的表达模式,主要在海马体 中表达。图中结果显示了这两个基因在海马体中有显著表达,并且与已知的表达模式一致(注意:点大小不是按比例缩放)。
图 小鼠脑组织3D 基因表达图谱展示
10x Genomics内部做的小鼠脑组织的分子图谱,共做了3只动物,75个区域,3万多个spot点,整合成小鼠脑组织的3D转录组表达, 可以直观的看出在脑组织的哪些区域有哪些细胞类型和基因表达。
Visium空间基因表达解决方案服务内容
- 样本前处理:冰冻,包埋,切片
- 样本质检;RIN值检测,完整性检测
- 空间转录组制备:空间转录组通透时间优化;DMi8扫片成像;正式空间转录组RNA捕获,构建文库
- 文库质检: 文库片段大小、浓度检测
- 测序分析:根据客户的需求确定测序数据量及定制分析内容
案例解析
本文的研究对象是皮肤鳞状细胞癌(cSCC),结合单细胞转录组测序、空间转录组及多路复用离子束成像技术(MIBI)技术,研究了人cSCC和配对的正常皮肤。发现cSCC有四个肿瘤细胞亚群,三个涵盖正常表皮状态的亚群,一个定位于纤维血管微环境的肿瘤特异性角质形成细胞亚群(TSK)。将单细胞和空间数据映射的配体-受体网络与特定细胞类型整合,揭示TSK是细胞间通讯的枢纽。观察到免疫抑制的多种特征,包括T调节细胞(Treg)与CD8 T细胞共定位于分隔的肿瘤基质中。最后,人类肿瘤异种移植物的单细胞表征和体内CRISPR筛选鉴定了肿瘤发生中起关键作用的特定肿瘤亚群富集基因网络。本研究分析了cSCC肿瘤和基质细胞亚群,它们相互作用的空间微环境,以及它们参与的癌症通讯基因网络。
空间基因表达技术:
采用异戊-烷/干冰对发育4.5-5,6.5,9周心脏组织进行冷冻,冷冻组织包埋在OCT中,分别切取4,6,9张,厚度为5 um组织切片贴在玻片上,而后组织切片进行苏木-精和伊-红染色(HE染色),以及明场显微镜成像,展现组织形态学。
随后,作者对组织透化时间进行优化,发现4.5-5,6.5,9周心脏组织最-优的透化时间分别是9,12,13min。根据最-优的透化时间,分别对组织进行透化,使组织释放出的mRNA分子与玻片上偶联的探针结合,而后进行反转录,cDNA的合成以及文库构建,拿到符合illumina测序的空间转录组文库。
10x Genomics 单细胞技术:
取6.5 PCW心脏组织消解成单细胞,重悬在HBSS+0.04%BSA中,采用10x Chromium平台,SC RNA-seq V2试剂对细胞进行标记,构建符合illumina测序的二代文库结构。每个细胞约测了77000 reads。
主要结果
本文作者采用空间转录组学对三个发育阶段的心脏组织进行研究。共获得了3115个spot的数据,过滤后每个spot检测到约1700个 基因和3800个unique转录本(该数据每个spot约检测到30个细胞)。随后,对获得的三个发育阶段转录组数据进行降维分析, 拿到基于基因表达的tSNE图谱,将基因表达图谱与HE染色结果map在一起,获得了心脏不同发育阶段具有空间位置的基因表达 谱(如图所示)
图 心脏三个发育时期,空间基因表达图谱
接着,作者对中期发育6.5周的心脏组织,进一步采用10x Genomics单细胞技术进行研究,获得了3717个单细胞转录谱,过滤后 每个细胞获得2900个基因和11000个unique转录本。对获得的数据进行降维分析,根据marker基因,共鉴定出15个细胞群(如 下图B所示)。在这15个细胞群中,有已知的心脏细胞类型,如心肌细胞,成纤维细胞,平滑肌和内皮细胞。此外,还检测了三 种类型的心肌细胞,心脏神经嵴细胞,雪旺祖细胞,心外膜细胞。两种类型的内皮细胞,四种类型的成纤维细胞样细胞。同时, 发现某些细胞簇只在心脏部位I中能够检测到(如下图展示的部位I)。这表明心脏上部组织细胞具有较高的多样性。
图 发育6.5周人类胚胎心脏单细胞分析