ROX Passive Reference Dye, 0.5

荧光定量 PCR 异常扩增曲线分析攻略

功能关闭，否则可能会出现图一左图所示的，扩增曲线异常的现象。遇到这种问题，可以在 Plate Setup 设置中找到 Passive Reference，把 ROX 改为 None，重新分析一下，结果就变正常了（图一右图）。Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪器默认是对所有荧光通道及所有样品孔进行荧光采集，用户不用担心数据丢失，实验完成后，还可以对设置错误的反应孔的荧光通道、样品名称等进行更改。 图一：使用不含 ROX 试剂，忘记更改 Passive

没有 CT 值，我的 QPCR 实验失败了吗？（下）

「Undetermined」（图 11A），但看多组分图时发现报告荧光有正常的扩增曲线，而 ROX 的荧光值却在 0 的位置（图 11B）。显然，这是使用了一种不含 ROX 的试剂，但未取消 ROX 分析导致的。这个数据只要在分析设置中将 Passive reference dye 从默认的 ROX 改成 None，再重新分析就可以得到正常的结果。 图 11 未加 ROX 导致扩增曲线异常 案例 8： 再来看一个相对少见一点的案例。在这个案例里，也是只有杂乱的扩增曲线，无法获得 CT 值（图 12A）。而查看多组分图

要想荧光定量 PCR 结果好，这些实验设置要点需记牢

the dye to use as the passive reference，也就是设置我们反应体系是否含有参比荧光。这里需要根据实际情况进行选择，不正确的定义参比荧光同样会导致最终结果的异常。例如图 7 中实验采用染料法进行相对定量分析，但是结果中的扩增曲线异常（图 7A），排查多组分图时发现 SYBR 在扩增循环过程中荧光信号变化正常，但是细致来看作为参比荧光的 ROX 信号却在整个反应过程中信号接近于零（图 7B）。我们知道扩增图谱纵坐标 ΔRn 的数值是报告基团荧光信号和参比荧光信号的比值