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上海谷研
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包
⒈溶液I—溶菌液:
溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
⒉溶液II-NaOH-SDS液:
NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。
但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。
铝箔封板膜 (非灭菌,100μm)在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:
(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
(2)解聚细胞中的核蛋白。
(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。
根据不同浓度的氯化钠溶液对DNA和蛋白质的溶解度不同原理,可以在提取不同类型DNA使用中加以利用。
1.Nacl是常用的盐析材料之一,盐析即在高浓度Nacl溶液中,蛋白质析出的现象。原理如下
(1)Nacl溶液与蛋白质争夺水分子,破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜;
(2)Nacl溶液大量中和蛋白质颗粒上的电荷,从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出;
2.不同浓度下DNA分子构象(三维结构)不同,不同的构象溶解度也不同。
(1)当NaCl溶液的浓度为0.14mol/L时,DNA溶解度最小,因此改变NaCl溶液的浓度既能使DNA溶解也能使其析出;
(2)DNA在不同浓度的氯化钠溶液中随着氯化钠的浓度不断升高;
3.所以可以使用适当的高浓度Nacl溶液,使得蛋白质析出,而DNA溶解度较大,通过高速离心,取上清并去除沉淀,进而去除蛋白质。
产品名称:铝箔封板膜 (非灭菌,100μm)
单位:包
产品信息:工作温度:-80℃- +120℃材质:非渗透软铝膜,达到医用级别。厚度:100μm规格:130mm×80mm100张/包储存:阴凉干燥处储存。铝箔封板膜适用于长期保存样品,优异的防蒸发性能,样品几乎无蒸发,易刺穿。特殊的设计揭取更加方便.产品用途主要用于96孔酶标板(ELISA))、96孔摇菌板(有氧培养需穿刺)、96孔保菌板、96孔PCR板,、48孔板的粘性密封及长途密封运输等;尤适用于化学发光、荧光等避光实验、封板膜可最大程度的防止蒸发。防止溢出和孔间污染,它提供可靠的密封,而不仅仅是盖膜。
DNA沉淀剂:
原则:不与DNA反应,对其无影响。
1.纯乙醇(二倍体积比);效率高,需要放置的时间短,在公司用Kit提取的时候,没有放置直接进行下一步;确定是价格相对昂贵。
2.95%乙醇,价格相对于纯乙醇便宜,但是会损失DNA;
3.异丙醇(0.6倍体积);
(1)普通细胞上清液体,静止15-30min即可沉淀;
(2)对于含量低,或者组织(比如我现在经常提取的小鼠的肝脏中的Total和cccDNA),则最好在-20℃放置2h或者以上,
本人提取肝脏组织DNA时候,最长时间放置了三天,对结果并无影响;上周提取细胞中cccDNA的时候,室温放置了15min,结果提出的DNA含量也挺高的,而且之后的Southern结果也很成功。我猜测可能是含量高,所以时间短点也可以,但是如果时间不是很着急,还是按照规定的时间来做比较保险。
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不必再处理。 处理的步骤如下: 1.在玻璃烧杯中注入去离子水,加入 DEPC 使其终浓度为 0.05%~0.1%(DEPC-H2O)。(DEPC 二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物,须在通风橱中小心使用) 2.将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入 DEPC-H2O,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通风柜中 37℃ 或室温下处理过夜。 3.将 DEPC-H2O 小心倒入废液瓶中,将装有 DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸汽灭菌至少
均会受到破坏,则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器(图Ⅵ-1)进行灭菌。该器底层盛水,顶部插有温度计,加热后水蒸汽温度达到100℃时,即循环流于器内,水蒸汽碰到器内物体时,又凝成水,流至底层贮水处,故不至干涸。灭菌时,将培养基放在器内,每天加热100℃30分钟、连续三天,第一天加热后,其中的营养体被杀死,将培养基取出放室温下18-24小时,使其中的芽孢发育成为营养体,第二日再加热100℃30分钟,发育的营养体又被杀死,但可能仍留有芽孢,故再重复一次,使彻底灭菌。一般凡能用高压蒸汽灭菌
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