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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存:
59
- 英文名:
Western Blotting Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit
- 保质期:
详见说明书
- 供应商:
上海博湖
- 保存条件:
-20℃,避光,有效期1年
- 规格:
瓶
产品参数:
| 产品名称 | DAB法显色试剂盒(兔IgG) |
| 英文名称 | Western Blotting Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit |
| 货号 | BH-DB6613 |
英文名称 Western Blotting Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit
储存条件 -20℃,避光,有效期1年
注意事项:
1、不同细胞或组织样品所需的固定时间有所不同,应当根据细胞或组织的种类以及组织块的大小来调整固定时间。
2、虽然作用温和,但能硬化组织,固定时间过久会导致组织变脆,切片时易碎。因此固定时间通常不宜超过 24 小时。
3、醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍。分子间交联形成的网格结构可能部分或 完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,可造成假阴性的染色,影响免疫组化结果。因此,4%固定的细胞或组织样品在进行免疫组化检测时,有时需要对抗原先进行修复,然后才能进行免疫染色等后续操作。
4、本产品对人体有害,操作时请小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
5、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作
操作步骤:
根据使用量,取每 1mL RIPA 加入 10uL PMSF,使 PMSF 的zui终浓度为 1mM。混匀备用(PMSF 现用现加)。
1、样品前处理:
a)对于贴壁细胞:去除培养液,用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照 6 孔板每孔细胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。
b)对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液,再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成 50-100 万细胞/管,然后再裂解。
c)对于组织样品: 把组织剪切成细小的碎片。按照每 20mg 组织加入 150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
2、后处理:
将裂解后的样品 10000-14000g 离心 3-5 分钟,取上清,即可进行后续的蛋白浓度测定、SDS-PAGE、Western blotting 和免疫沉淀等操作。
温馨提示:
工作液与浓缩液选择的技巧,以及各自的优势。
1,工作液的优势:工作液操作方便,降低实验操作步骤,对于要求无菌的实验,降低染菌风险。
2,浓缩液的优势:浓缩液成本相对较低,实验范围更广,对于不要求无菌的实验,可以进行多种浓度的实验分析以及比较。而且由于浓度高,保存更加稳定。
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文献和实验。6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加 Ⅰ 抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃ 20 分钟。10)PBC 洗 3 次每次 2 分钟。11)滴加试剂SABC,20℃~37℃ 20 分钟。12)PBS 洗 4 次每次 5 分钟。13)DAB 显色:DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。14)蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。15)脱水、透明
两者所用的显色系统也不同。SP法与SAP法的其他染色步骤同SABC法。 Envision TM SVStemS 该法是近几年在国内推广使用的一种方法,它的原理是将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶结合形成聚合物。以代替传统方法的二抗和三抗,直接与特异性第一抗体结合,从而放大了抗原抗体结合的信号,使检测变得简单而且敏感性增加。经DAB显色即可完成染色,其他染色步骤与SABC法相同。 Envision TM SVStemS原理示意图
说明:这是我今年做免疫组化的一点体会,奉献给大家。如有不正确的地方,敬请指教。同时,这也是我应付《免疫组化》的一份作业,老师给了我85分。斑竹呀,如果觉得有点用,就请鼓励一下,加点分吧!:D:D:D应用SABC法进行免疫组化染色的体会SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性(pH=6.0-6.5),对组织和细胞的吸附性特别低,因而具有较低的背景。它的步骤
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