牛脾脏中性粒细胞分离液试剂盒

注意：本产品试剂组分和操作步骤发生变化，使用前请仔细阅读说明书。 

保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期 2 年。无菌开封后，保存于室温。 

试剂盒组成： 

试剂 A 200mL 室温避光 

试剂 C 100mL 室温避光 

红细胞沉降液 100mL 室温 

细胞洗涤液 200mL 室温 

操作步骤一： 红细胞沉降（仅供参考） 

沉降去除红细胞：

取脾脏单细胞悬液与血液稀释液(注射用生理盐水或 1XPBS)及红细胞沉降液按照 1:1:1 比例混匀，室温下静置 30-40min 后，可见红细胞沉于试管底部，小心吸取上清层(富含白细胞 及血小板)用于后续细胞分离。 

操作步骤二： 样本分离（仅供参考） 

1. 样本分离：当样本体积小于 5mL 时,先在离心管中先加入 4mL 试 剂 A，后将 2mL 试剂 C 小心叠加于试剂 A 之上，形成梯度界面(样 本体积大于等于 5mL，试剂 A 与试剂 C 比例 2:1，试剂总量等于沉 降后样本含量),将悬液小心平铺于分离液液面上方。由于密度差异， 可见明显的分层界面(注意二者的总体积不能超过离心管的三分之二， 否则会影响分离效果)。 

2. 室温条件下水平转子 600-1000g ，25-30min(血液体积越大所需 离心力越大,离心时间越长,最佳分离条件需摸索，离心最大转速不超 过 1000g)。

3. 离心后，离心管中可见两个环状乳白色层，上层为单个核细胞层,下层即所需中性粒细胞层(受 个体差异及分离条件影响，粒细胞白膜层可能会出现颜色较浅的情况)。 

4. 用吸管吸取下层中性粒细胞白膜层至新的离心管中，加入 10mL 细胞清洗液洗涤细胞，250g，离 心 10min。 

5. 弃上清,加入 5mL 细胞清洗液重悬细胞,250g，离心 5min。 

6. 弃上清，重悬细胞备用。

脾脏单细胞悬液制备： 

脾脏研磨的方法： 

1. 无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。 

2. 将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证脾脏及获得的 细胞处于液体环境中）。 

3. 将脾脏放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脾脏（尽量控制研磨力度，保持 筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡） 

4. 研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。 

注： 

A. 可用酶消化法，使用胶原酶对脾脏组织进行消化，得到单细胞悬液。 

B. 如果最终得到的细胞需要培养，那全过程所需试剂与器材均要求无菌。 

C. 根据脾脏的体积控制单细胞悬液的浓度在 10 8 ~10 9个/mL。 

注意事项： 

A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免 微生物污染。 

B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是 温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层不清晰。 

C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血 2h 以内），为保持中性粒细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 

D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含 Ca、Mg 离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集， 大大降低细胞得率及纯度。 

E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 

F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索 最佳的分离条件。 

G.如果要进一步对分离的细胞进行培养，注意全程保持无菌操作，避免微生物污染。 

H.不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提 供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。