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- 普利莱
- 北京
- E2003
- 2025年11月20日
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-20℃
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一年
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大量
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北京普利莱基因技术有限公司
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100次
描述：液体样本谷胱甘肽还原酶检测试剂盒（Glutathione Reductase Assay Kit）是一种灵敏简单的利用比色法检测谷胱甘肽还原酶（GR）活性的试剂盒。谷胱甘肽包括还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSH 是细胞中巯基的主要来源，对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用。GR广泛分布在各种组织细胞和体液中，可以还原GSSG生成GSH，维持细胞内或体液中充足的GSH。
原理：GR可以将GSSG还原为GSH，GSH可以和DTNB反应生成黄色的TNB和GSSG。在GSSG和DTNB相对过量的条件下，利用该反应可以通过测定生成TNB的吸光度（A412nm）定量检测GR活性。
本试剂盒以GSH以TNB标准品和反应时间定量GR酶活性。检测线性范围为4.7-150mU/ml，灵敏度≤4.7mU/ml。
适用范围：本试剂盒能够检测动物血浆、裂解液上清等多种其它生物样本中的GR活性。
所需设备：酶标仪，最佳工作波长412nm
组成：
| 组份名称 | 规格 | 数量 |
| 谷胱甘肽还原酶检测缓冲液 | 50ml/瓶 | 1 |
| 样品稀释液 | 50ml/瓶 | 1 |
| DTNB | 4mg/管 | 1 |
| TNB溶液（300μM） | 1 ml/管 | 1 |
| 谷胱甘肽（GSSG） | 12 mg/管 | 1 |
| 谷胱甘肽还原酶（GR） | 50μl/管 | 1 |
| NADPH | 5 mg/管 | 1 |
| DMSO | 1.2 ml/管 | 1 |
操作步骤：
1. 样品的准备
血浆样品或红细胞裂解液的准备：取新鲜抗凝血至少0.5ml，4℃,1000g离心5分钟，上清为血浆。对于沉淀中红细胞，利用冰冷PBS洗涤3次。取约5倍红细胞体积的冰冷的纯水，重悬细胞沉淀，冰浴10分钟。4℃，10000g离心10分钟。取上清进行蛋白浓度定量后用于谷胱甘肽还原酶的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中谷胱甘肽还原酶活性超出测定范围，可利用样品稀释液适当稀释后测定，稀释倍数请通过预实验确定。
2. 试剂盒的准备
2.1 GSSG储备液的配制：在本试剂盒提供的12mg GSSG中加入1ml的纯水，溶解并混匀，即为GSSG储备液，浓度为10mM。
2.2 DTNB储备液的配制：在本试剂盒提供的4mg DTNB中加入1ml本试剂盒提供的DMSO溶解并混匀，即为DTNB储备液，浓度为10mM。
2.3 NADPH储备液的配制：在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml纯水，溶解并混匀，即为NADPH储备液，浓度为5mg/ml。
2.4 谷胱甘肽还原酶检测工作液的配制：根据待测样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液，表中试剂按比例混合后即为谷胱甘肽还原酶检测工作液。
| 1个样品 | 10个样品 | 50个样品 | |
| 谷胱甘肽还原酶检测缓冲液 | 125μl | 1.25ml | 6.25ml |
| GSSG储备液 | 10 μl | 100μl | 500μl |
| DTNB储备液 | 5 μl | 50 μl | 250μl |
3. 标准品的准备
将300μM的TNB溶液用谷胱甘肽还原酶检测缓冲液稀释成150、75、37.5、18.8、9.4 μM浓度的TNB溶液，用于标准曲线测定。在本试剂盒相同反应体系下TNB标准曲线只需要测定1次，后续测定只需利用该标曲进行酶反应产物TNB生成量的计算。
4. 测定方法
-
- TNB标准曲线测定：利用上述系列浓度TNB标准品，各取200μl到96孔板中，TNB各孔加入量分别为60、30、15、7.5、3.75、1.88、0nmol，测定A412nm。
- 参考下表，使用96孔板，依次加入谷胱甘肽还原酶检测工作液、样品后，混匀，25℃或室温孵育2分钟。
| 空白对照 | 阳性对照 | 样品 | |
| 谷胱甘肽还原酶检测工作液 | 140 μl | 140 μl | 140 μl |
| 谷胱甘肽还原酶 | ─ | 1μl | ─ |
| 样品 | ─ | ─ | 10 μl |
| 样品稀释液 | 11μl | 10 μl | 1μl |
| 25℃孵育 | 2 min | 2 min | 2 min |
| NADPH工作液 | 50 μl | 50 μl | 50 μl |
| 25℃孵育 | 20 min | 20 min |
|
-
- 各孔加入NADPH工作液50μl，25℃孵育20分钟。
5. 数据处理
利用TNB标准品的量为横坐标，吸光度值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用该标准曲线和各样品的吸光度值计算样品中一定时间段(注：计算酶活性时间段最好采用5-15分钟时间段，这样可以避免样品本身的颜色及样品中较高浓度GSH和NADPH对反应的干扰)内产生的TNB量，从而换算为谷胱甘肽还原酶活力（注意精确计时）。由于有多个时间点的测定，可以选择时间线性良好的时间段计算谷胱甘肽还原酶活力。
谷胱甘肽还原酶定义：在25℃，pH 7.6条件下，每分钟还原1.0μmol GSSG为GSH的谷胱甘肽还原酶为1 U，1 U=1000 mU。
计算公式：酶活力(mU)=TNB生成量（nmol）/2/反应时间(min)。
TNB标准曲线及阳性对照谷胱甘肽还原酶测定如下图所示：
参考文献
1. Foyer, C.H., Lelandais, M., and Kunert, K.J., 1994. Photooxidative stress in plants. Physiol. Plant. 92, 696-717.
2. Baillie, T.A. and Slatter, J.G., 1991. Glutathione: A vehicle for the transport of chemically reactive metabolites in vivo. Acc. Chem. Res. 24, 264-270.
注意事项
1. 本试剂盒检测涉及氧化还原反应，很多氧化剂和还原剂都会干扰试剂盒的测定，特别是巯基乙醇、DTT等含有巯基的试剂会严重干扰本试剂盒的测定；另外硫酸钠、硫酸铵也会干扰本试剂盒的测定，请尽量避免。
2. 严格控制反应的温度和反应时间，样品中酶活性过低时，可适当延长反应时间。
3. TNB标准曲线只需测定1次即可，主要用于酶标板测定体系下校正吸光系数，传统文献报道的TNB吸光系数适用于分光光度计测定。
4. NADPH在溶液中容易分解，要严格按储存条件保存。
5. 初次使用试剂盒时，粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。
6. 本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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文献和实验多因子检测外包实验介绍虽然液相蛋白定量检测的技术很多，但是大多数的技术仅能对样本进行单一指标的检测，同时检测多个指标时则需要提供大量的样本分批检测，操作繁琐，且各指标间差异性较大。对于样本量较少或需要对比各指标的用户，传统的技术无法满足需要。日常实验中，常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测，如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析，由于这些因子的含量较少，低于一般常规方法的检测下限，使用常规的蛋白检测方法Western Blot等很难检测。为此，著名的流式抗体公司BD-Pharmingen
Oxford Biomedical Research的氧化应激及慢性炎症生物标志物检测
., Roberts II, L.J., Meth. Enz. 300: 3-12 3. 肌酸酐检测试剂盒，货号CR01，96孔板：主要用于标准化人尿样中的分析物，与其他检测试剂盒配套使用。 4. 山羊抗15F2t-异前列烷，纯化的IgG，多抗，适用于免疫组化、酶联免疫、蛋白杂交，货号IS20，0.1 mg。 5. 葡糖醛酸糖苷酶样品预处理试剂盒（尿液预处理），货号GL85，40个样本：与ELISA试剂盒配套使用。人尿液中平均50%的异前列烷与葡糖
。1536 孔球形微孔板建议采用自动液体进样。 * 在手动接种过程中，请确保移液管吸头不会刮伤孔的底部或侧面，以免损坏 Corning® 超低附着表面涂层。 **如果使用自动液体进样器，请增加稀释体积以考虑灌注仪器体积和管道的长度 (10 mL)。 将球形微孔板置于设置为 37 °C 和 5% CO2 的加湿培养箱中。 观察评估 0、24、48 和 72 小时时间点的球状体形成和生长，并进行细胞活力测定。如实验设计时间更长，每 3-4 天更换一半培养体积的新鲜 3dGRO™ 球状体培养
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