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- 普利莱
- 北京
- P1700
- 2025年12月08日
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北京普利莱基因技术有限公司
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750次
胶原蛋白酶2,9检测试剂盒 (MMP Zymography assay kit) P1700
描述：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。胶原酶通过影响细胞外基质参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆和组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视1。
本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一种广为使用的、基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法2，其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 µl血液中的MMP-2、MMP-9酶谱及活性，检测灵敏度约为1 nM。试剂盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。
参考文献：
适用: 检测MMP-2、MMP-9酶谱及活性
组成与储存 (50 assays)：12个月有效
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml , −20 ºC 储存
2. 10 × Substrate G 50 ml −20 ºC 储存
3. 10 × Buffer A 50 ml 4 ºC 储存 使用时用蒸馏水稀释
4. 10 × Buffer B 50 ml 4 ºC 储存 使用时用蒸馏水稀释
5. SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(货号P1501) 4 ºC储存
操作步骤：
说明
描述：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。胶原酶通过影响细胞外基质参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆和组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视1。
本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一种广为使用的、基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法2，其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 µl血液中的MMP-2、MMP-9酶谱及活性，检测灵敏度约为1 nM。试剂盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。
参考文献：
- Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
- Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202
适用: 检测MMP-2、MMP-9酶谱及活性
组成与储存 (50 assays)：12个月有效
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml , −20 ºC 储存
2. 10 × Substrate G 50 ml −20 ºC 储存
3. 10 × Buffer A 50 ml 4 ºC 储存 使用时用蒸馏水稀释
4. 10 × Buffer B 50 ml 4 ºC 储存 使用时用蒸馏水稀释
5. SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(货号P1501) 4 ºC储存
操作步骤：
- 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS-PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，90 ºC加热5分钟，分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入\\和TEMED，等待凝胶聚合。
- 待测样品1:1稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100µl全血与100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer等体积混合，取5-15µl上样。
- 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
- 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 18小时，中间换液。
- 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小时即可显示。如MMP活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。
- 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。
- 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中最常见的格式。
说明
- 10 mM能够 EDTA完全抑制MMP活性。
- 凝胶干燥：可使用(货号P2000)室温快速干燥凝胶，作为永久记录保留。
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