敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

产品名称：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)
英文名称：Enhanced Sensitive ISH Detection kitⅠ(POD)
规格    100T/盒
特异性    标记的寡核苷酸探针
保存条件    4°C保存一年
内容    1.胃蛋白酶（×10;Pepsin）：2ml；
2.预杂交液：2ml；
3.寡核苷酸探针杂交稀释液：2ml；
4.封闭液：5ml；
5.生物素化鼠抗：5ml；
6.SABC-POD：5ml；
7.生物素化过氧化物酶：5ml；

培养细胞和冰冻切片：
敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
原位杂交检测步骤：
原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1. 玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2. 样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3. 探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4. 原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
杂交流程：
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+  90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours。
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沙氏葡萄糖液体培养基用于白色念珠菌的培养。    沙氏葡萄糖肉汤培养基    250g
用于白色念珠菌的增菌。（中华人民共和国药典2010版、GB16294-2010）。    沙氏葡萄糖液体培养基    250g
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用于真菌的分离培养，还用于一次性使用卫生用品真菌菌落总数检测。(GB)    沙氏琼脂培养基    250g
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用于真菌的分离培养，还用于一次性使用卫生用品真菌菌落总数检测。    沙氏琼脂平板    90mmX20个
用于真菌的增菌培养，还用于一次性使用卫生用品真菌定性检测。(GB)    沙氏液体培养基    250g
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用于致病性大肠杆菌(包括O157：H7)的分离培养(SN/T0973-2000和SN/T 1827-2006 )。    山梨醇麦康凯琼脂基础(SMAC)    250g
用于致病性大肠杆菌(包括O157：H7）的分离培养。    山梨醇麦康凯琼脂平板    90mmX20个
细菌生化鉴定    山梨醇生化鉴定管    20支/盒
细菌生化鉴定    山梨糖    20支/盒
用作稀释液。    生理盐水    225ml/X10袋
将未灭菌与灭菌的物品区分开、蒸汽胶带灭菌后由白色变为黑色。    湿热指示胶带    18mm*55mm
用于绿脓杆菌及其它革兰氏阴性非发酵菌的选择性分离培养(GB15979-2002，化妆品卫生规范微生物检验...    十六烷三甲基溴化铵培养基    100g
用于绿脓杆菌及其它革兰氏阴性非发酵菌的选择性分离培养。(GB)    十六烷三甲基溴化铵琼脂    250g
用于绿脓杆菌及其它革兰氏阴性非发酵菌的选择性分离培养。(GB)    十六烷三甲基溴化铵琼脂    100g
用于绿脓杆菌及其他革兰氏阴性非发酵菌的选择性分离培养。    十六烷三甲基溴化铵琼脂平板    90mmX20个
用于嗜热乳酸链球菌的生化鉴定    嗜热乳酸链球菌生化鉴定盒    7种×10次/盒
用于灭菌与消毒鉴定试验。（WS）    嗜热脂肪杆菌恢复琼脂培养基    250g
细菌生化鉴定    鼠李糖生化鉴定管    20支/盒
用于药品中大肠杆菌、沙门氏菌检测。（《中华人民共和国药典》2010年版）    曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）    250g
用于药品中大肠杆菌、沙门氏菌检测。（《中华人民共和国药典》2010年版）    曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）    250
用于药品中大肠杆菌、沙门氏菌检测。    曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）    250g
用于双歧杆菌的平板计数    双歧杆菌琼脂培养基（BBL琼脂培养基）    250g
用于鉴别肠道菌发酵葡萄糖和乳糖，及产生的生化反应。    双糖铁斜面    20支
适用于扩散法进行药敏试验。    水解酪蛋白胨(MH)琼脂    250g
灭菌后冷却至45℃左右时加入5%的脱纤维羊血，配成Mueller Hinton 血平板，用于空肠弯曲菌的药敏试...    水解酪蛋白胨（MH）琼脂    250g
适用于稀释法进行药敏试验。    水解酪蛋白胨(MH)肉汤    100g
细菌生化鉴定管    水杨素生化鉴定管    20支/盒
用于霍乱弧菌的选择性分离培养。    四号琼脂    250g
含亚碲酸钾，用于霍乱弧菌的选择性分离培养。    四号琼脂平板    90mmX20个
用于四环素族残留的一种微生物学检定（GB/T9695.16-88和SN0179-92）。    四环素检定培养基    100
用于四环素族残留的一种微生物学检定（GB/T9695.16-88和SN0179-92）。    四环素检定培养基    100g
含碘液2ml/支和煌绿1ml/支，2支添加于100mL（023030）中配成TTB    四酸钠煌绿增菌液    2X5支
用于沙门氏菌的选择性增菌培养。    四钠煌绿增菌液（TTB）    10mlX20支
含碘液2ml/支和煌绿1ml/支，2支添加于100mL（023030）中配成TTB    四钠煌绿增菌液（换用方法）配套试剂    2种*5支/盒
用于沙门氏菌选择性增菌培养    四煌绿增菌液基础(TTB)    250g
含碘液和煌绿，2支添加于100mL(023030)中配成TTB。    四钠煌绿增菌液配套试剂    2×5支/盒
用于沙门氏菌选择性增菌培养（《中华人民共和国药典》2010年版）。    四钠亮绿培养基基础（TTB）    250g
含碘液和煌绿，2支添加于100ml（023031）中配成TTB.    四钠亮绿培养基配套试剂    2X5支
含碘液和煌绿，2支添加于100mL(023031)中配成TTB。    四绿培养基配套试剂    2×5支/盒
含碘液2ml/支和煌绿1ml/支，2支添加于100mL（023031）中配成TTB    
培养基原材料    酸水解酪蛋白胨    400g
用于酸性罐头食品商业无菌检验    酸性肉汤    250g