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- 泽叶生物
- ZY-XJ14-63600
- 中国
- 2025年07月12日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
50
- 英文名：
Enterinvasive E.coli qPCR Kit(Dye Method)
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海泽叶生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
50次
试剂盒组成：
| 组分 | 规格 |
| 荧光PCR反应液(ESKZ-qPCR MIX) | 672μL |
| DNA抽提液(DNA Extraction ) | 2mL |
| 酶混合物(DNA Polymerase MIX) | 48μL |
| 阴性对照(NTC) | 50μL |
| 阳性对照(ESKZ -PTC) | 50μL |
储存条件：-18℃以下，有效期6个月。
使用方法：
一、样品采集：
1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验肠侵袭性大肠杆菌检验(GB/T 4789.40-2008)要求进行。
2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
- DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购上海泽叶生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。 - 三、检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(ESKZ -qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
| 试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 |
| 荧光PCR反应液 | 14 μL | N×14μL |
| 酶混合物 | 1 μL | N×1 μL |
| 总量 | 15 μL | N×15μL |
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ESKZ -PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：
| 1循环 | 50℃ for 2 min | |
| 预变性 | 1循环 | 95℃ for 10min |
| PCR扩增 | 40循环 | 95℃ for 15s 60℃ for 60s |
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM
四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
1）阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
2）阳性对照(ESKZ -PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤35。
3）以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
1）在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明肠侵袭性大肠杆菌核酸阳性。
2）Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明肠侵袭性大肠杆菌核酸阴性。
3）如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
4）对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行肠侵袭性大肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明肠侵袭性大肠杆菌核酸阳性；否则判为样本阴性。
五、注意事项：
1）初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
2）所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
3）PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
4）样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
5）试剂盒里所有物品应视为污染物对待，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
样本采集：
目前大多为呼吸道标本，包括上呼吸道样本（鼻拭子、咽拭子、鼻咽冲洗液）和下呼吸道样本（深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等）。
上呼吸道样本优点是取材容易，尤其是咽拭子在大规模采样的时候容易操作，但是如果咽拭子的样本采集所得的细胞数目过少，可能导致病毒核酸量不够，检测结果出现偏差。
下呼吸道样本一般病毒的拷贝数较高，但临床上一般使用支气管纤维镜进行取材，采集方法比较复杂，对操作者和设备要求高。所以目前样本采集还是以咽拭子为主。
样本保存：
样本采集之后尽快置于2-8℃保存，在72小时内进行检测，如不能及时检测，则需置于-70℃保存。
咽拭子建议直接放在病毒保存液中保存，检测结果显示湿拭子的提取检测效率比干拭子高。
提取的核酸应在-70℃或以下保存，检测之前不要冻融核酸标本超过1次。
生物安全注意事项：
在应对病毒疫情的过程中，作为病毒检测确认的关键技术，核酸检测在其中发挥了极其重要的作用。
PCR病毒的检测包括 “样本采集” “直接或灭活后提取核酸” “扩增检测核酸” 三部分，以上为泽叶生物特别给与的注意事项。
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