3i VIVO Intravital成像平台研发的目的主要就是应用于血栓的观察,它的基础是一套包含超大工作样品台的正置荧光显微镜,搭配脉冲激光烧蚀组件,能够刺激血管损伤以及诱导血栓形成,并进一步实现血栓形成和消失的整个过程的明场及荧光成像。升级转盘共聚焦扫描头后,系统获得高速光学层切和三维重构能力,并且在分辨率方面也有了质的提升,实现单细胞分辨率的成像,能够进行血管内单个细胞的追踪和成像,从细胞甚至亚细胞水平研究血栓形成和消失的动态过程。
血液的凝固机制是在血管受损时保证血压在封闭的血管系统中存在的重要的人体防御机制。在病理过程中炎症和动脉粥样硬化都与血栓形成有着密切的关联。这些对于心血管疾病的研究有着举足轻重的意义。在传统的血栓诱导实验中,通常的方法是在小鼠模型上使用FeCl3来诱导血栓的形成。这种方法无法直接in-vivo的观察与记录到血栓形成与消失的整个过程。为了解决这一方法学的问题Dr. Bruce Furie (Professor of Medicine at Harvard University and Chief of Hemostasis-Thrombosis at Beth Israel Deaconess Medical Center)在2000年开展了这方面的研究并与Intelligent Imaging Innovations公司开展了关于此方法学应用的显微镜研发。2002年Dr. Bruce Furie的研究成果“Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse”被发表在著名期刊Nature Medicine(IF=29.886)上,并被引用了700余次,成为了近5000篇关于血栓形成和炎症中性粒细胞-血小板相互作用文章的基础。
文章中使用的VIVO Intravital显微成像系统包含一套正置荧光显微镜。标配的大型工作区域可安装多个机械手和为组织及动物成像准备的大型托盘。内置355nm或532nm脉冲激光器(>60µJ pulses at 200Hz),用以进行对显微图像中任意位点的血栓精确诱导。通过调节脉冲激光的强度可对不同尺寸的血管进行血栓诱导。该系统适用于各类血管床(dermis/skin-flap, mesentery, cremaster, cerebral-microvessels (via cranial window))以及较大的血管(femoral and carotid arteries)的荧光与明场成像。系统拥有包括明场在内的多个荧光通道同时成像功能,并在诱导与成像间无缝隙切换,使得用户可以观察到血栓在诱导前,诱导时与诱导后的整个产生与消失的过程。选配转盘共聚焦扫描头后,系统可被升级为转盘共聚焦显微镜,提供高速光学层切以及三维重构能力。整套系统由Slidebook软件驱动进行图像采集及后期的图像处理和数据分析。其内置的图像分析软件可实现对实验结果进行去三维重构,去卷积计算,模式识别,以及颗粒追踪与定位等功能。
Fig. 1 小鼠提睾肌静脉血栓诱导多色成像实验灰色:血管明场成像,红色:血小板
Fig. 2 Neutrophils and platelets in the inflamed cremasteric venules of a WT mouse, 3h after local injection of TNFa. Cells are labeled by injection of low amounts of antibodies anti-Ly6G conjugated to DyLight649, anti-CD41 conjugated to PE and anti-CD62P conjugated to FITC.
The movie shows the dynamic capture and release of platelets (red) by a crawling neutrophil (white), some of which are activated as indicated by the expression of CD62P (green).Courtesy of Dr. Vinatha Sreeramkumar & Dr. Andrés Hidalgo (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares).