保存条件: 固定液和细胞核染色液-20℃保存,其余试剂均4℃保存,半年有效。其中抗兔Cy3和细胞核染色液需避光保存。 注意事项: 固定液对人体有害,操作时请特别小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。 免疫荧光染色时,请注意回收使用过的NF-κB p65抗体和抗兔Cy3。回收后至少可以重复使用10次。 需使用可以观察红色荧光和蓝色荧光的荧光显微镜。 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明: 1. 对于贴壁细胞: a. 吸除培养液,用PBS洗涤1次。 b. 加入固定液,固定5-15分钟。固定液的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入1ml固定液。 c. 吸除固定液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。 d. 加入免疫染色封闭液,室温封闭1小时。免疫染色封闭液的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入1ml免疫染色封闭液。 e. 吸除免疫染色封闭液,加入NF-κB p65抗体,室温孵育1小时或4℃孵育过夜。 f. 小心吸出NF-κB p65抗体到适当的容器内,4℃保存,留做下次使用。 g. 洗涤液洗涤3次,每次5-10分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。 h. 加入抗兔Cy3,室温孵育1小时。抗兔Cy3的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入1ml抗兔Cy3。 i. 小心吸出抗兔Cy3到适当的容器内,4℃保存,留做下次使用。 j. 洗涤液洗涤2次,每次5-10分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。 k. 加入细胞核染色液(DAPI),室温染色5分钟左右。细胞核染色液的用量充分盖住样品即可,对于6孔板中的样品,通常加入1ml细胞核染色液。 l. 吸除细胞核染色液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。 m. 滴加适当量的抗荧光淬灭封片液,盖玻片封片后荧光显微镜下观察。NF-κB的染色为红色荧光,细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。 2. 对于悬浮细胞: a. 离心收集细胞,PBS洗涤1次。吸尽PBS后把细胞适当弹散。 b. 加入固定液,轻轻悬浮细胞,固定5-15分钟。 c. 离心,去除固定液。 d. 加入洗涤液洗涤1次。 e. 取少许洗涤液重悬细胞,滴加到盖玻片或载玻片上,做成涂片。充分晾干后继续后续操作。 f. 洗涤液洗涤2次,每次5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体,同时要保持样品表面有些湿润,不能干掉,最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。 g. 转1.d。后续步骤同1.d起的步骤。 3. 对于组织切片: a. 对于石蜡切片先进行常规的脱蜡和水化处理,对于冷冻切片可以直接进行后续步骤。 b. 转1.b。后续步骤同1.b起的步骤。