miRNA荧光定量检测试剂盒（染料法)优惠促销

特别提示：包括miRNA荧光定量检测试剂盒（染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：miRNA荧光定量检测试剂盒（染料法)
英文名称：miRNA qPCR Kit
产品货号：WH0132
产品规格：20μl×125次|20μl×500次

本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本试剂盒包含miRNA荧光定量检测的所有试剂，包括2×miRNA PreMix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer。

2× miRNA PreMix（SYBR&ROX)是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，其中的DNA Polymerase采用的是化学修饰的热启动形式，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

本试剂盒须与miRNA cDNA第一链合成试剂盒（WH0131)配套使用。

产品特点：
·灵敏度高：可在pg级的总RNA中检测到目的miRNA。
·特异性强：体系全新升级，更好的区分单碱基的差异，完美区分家族中的不同miRNA。
·通用性好：适用于各种类型的荧光定量PCR仪。

使用实例：

人类let-7家族的所有3p miRNA共有10条，彼此之间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。以这10条miRNA mimics为模板，以不同引物，使用本试剂盒分别扩增10条miRNA。结果显示，特异性引物只会扩增特异性模板，非特异性识别率低于5%，表明本试剂盒具有良好的特异性，能够区分单碱基差异的miRNA。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次
2×miRNA PreMix（SYBR&ROX)	1.25ml	4×1.25ml
Reverse Primer（10μM)	55μl	220 μl
50×ROX Reference Dye	250 μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1 ml	5×1 ml

储存条件：-20℃下可保存1年。收到本产品后，请立即置于-20℃下避光保存。从-20℃中取出使用时，将冻存的各个组分融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后的2×miRNA PreMix没有使用，须彻底混匀后再重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。

适用的Real Time PCR扩增仪:
ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast RealTime
PCR System,Step one/Step one plus PCR System （Applied Biosystems)
OPTICONTM/CFX96 （BIORAD)
Light Cycler480 （Roche)
Smart Cycler? System （Cepheid)
Mx3000P/Mx3005P （Stratagene)
Line-Gene （Bioer，杭州博日)
其它各种Real Time PCR扩增仪

需自备的试剂:
1．分子生物学实验级别的水（无核酸酶)；
2．PCR上游引物（Forward Primer)（可选购我司WH0133、WH0134系列miRNA上游引物）。

Forward Primer设计原则
1．遵循引物设计的最普遍原则。
2．以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础的设计方法。
3．试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。
4．若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5"端添加几个碱基（最好为G或C碱基)来调整Tm值，但应避免引入二级结构；
5．若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5"或3"端去掉几个碱基。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本品或配制PCR反应液过程中应避免强光照射。
2．反应液的配制和分装中，请一定使用新的（无污染的)枪头等耗材，尽量避免污染。

操作步骤：
1．室温融化2×miRNA PreMix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer。
2．使用时请将2×miRNA PreMix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。
  注：如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降，且不要使用振荡器混匀。
3．将试剂置于冰上，并按表1配制反应体系：
  注：使用ABI公司：PRISM7000/7300/7700/7900HT，Step one/Step one plus PCR System荧光定量仪器需按照表2进行加样。
  表1

成分	50μl体系	20μl体系	终浓度
2×miRNA PreMix（SYBR&ROX)	25μl	10μl	1×
Forward Primer（自备)	-	-	200nM
Reverse Primer（10μM)	1μl	0.4μl	200nM
miRNA第一链cDNA	-	-	-
ddH2O	至50μl	至20μl	-

  表2

成分	50μl体系	20μl体系	终浓度
2×miRNA PreMix（SYBR&ROX)	25μl	10μl	1×
Forward Primer（自备)	-	-	200nM
Reverse Primer（10μM)	1μl	0.4μl	200nM
miRNA第一链cDNA	-	-	-
50×ROX Reference Dye	4 μl	1.6 μl	5×
ddH2O	至50μl	至20μl	-

  注：miRNA第一链cDNA的加入量不要超过Real time PCR体积的1/10。高浓度cDNA易导致非特异扩增，可对cDNA适当稀释（10倍或者100倍)。表2中，PreMix中的ROX和额外添加的ROX混合后，终浓度为5×。

PCR反应程序设置：
1．一般情况下，可采用如下述程序进行定量PCR反应：

循环	温度	时间	内容
1×	95℃	15min	起始模板变性
40-45×	94℃	20sec	PCR循环中模板变性
	60℃	34sec	退火,延伸
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

2．如需提高低丰度miRNA的检测特异性和检出率可采用下述程序进行定量PCR反应：

循环	温度	时间	内容
1×	95℃	15min	起始模板变性
5×	94℃	20sec	富集低丰度目标miRNA， 无需收集荧光信号
	63～65℃	30sec
	72℃	34sec
40～45×	94℃	20sec	PCR循环中模板变性
	60℃	34sec	退火,延伸
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

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