使用说明: 1. 需要用户自己准备的器材和试剂: a. 白色或黑色的96孔板或384孔板,以及适合96孔或384孔板检测的具有化学发光检测功能的多功能酶标仪;或者可以进行单个样品化学发光检测的化学发光仪(luminometer)及配套可以用于样品检测的适当容器,如离心管、酶标条管等。 b. 待检测的激酶、激酶底物、激酶反应用ATP和激酶反应缓冲液。 2. 试剂准备 a. 激酶催化的反应结束后可立即进行ATP检测,也可-80℃冻存后再检测。样品检测前需平衡至室温(约25℃),并混匀。 b. 检测试剂使用前需平衡至室温,并混匀后使用。 3. 激酶活性检测 以下是96孔板推荐检测体系,384孔板等可以参考96孔板的检测体系进行: a. 激酶反应:在激酶反应体系中,加入适量的反应缓冲液、激酶底物、ATP和激酶,总体积为50μl,反应适当时间。ATP的用量和反应的时间以使20-90%ATP转化为ADP为宜,以使30-70%ATP转化为ADP为更佳。具体的反应条件,需根据特定的激酶,参考文献资料自行摸索。 b. ATP标准曲线设置:设置0、1、2、4、8、16、32、64、128、200μM标准品孔(标准品孔中ATP的最高浓度可以根据激酶反应体系中的ATP浓度自行调整),每孔50μl。ATP用激酶反应缓冲液稀释。 c. 在样品孔和标准品孔中,加入50μl Kinase-Lumi™超强型化学发光法激酶检测试剂,混匀。 d. 室温(约25℃)反应10分钟,然后用多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。 e. 根据标准曲线计算出样品孔中剩余的ATP量,随后根据酶活力的定义计算出酶活性。ATP标准曲线可以参考图2,在0-200μM范围内存在良好的线性关系。
补充说明: 关于激酶反应条件的优化 a. 关于ATP浓度:筛选激酶抑制剂时,使用低浓度的ATP(10μM或更小),适合优先筛选出ATP竞争性抑制剂。如果需要优先筛选ATP非竞争性抑制剂,建议使用较高浓度的ATP。一旦ATP浓度改变,酶和底物浓度以及反应温度和孵育时间都要相应再进行优化。 b. 关于底物浓度:通常底物宜处于过量的条件,实际用量以确保激酶加入孔和未加入激酶孔的最终的化学发光值差别最大为佳。可以通过设置底物的浓度梯度进行摸索。 c. 关于激酶用量:激酶用量也可以通过设置激酶的剂量梯度进行摸索,并先尝试把反应时间相对固定在10或20分钟等。激酶用量和反应时间,以使ATP含量的变化为30-70%为最佳。 常见问题: 1.Luminometer和荧光分光光度计有何不同? 荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(即萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。 2.可以进行萤光素酶报告基因检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测? 是。萤光素酶报告基因的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。