Human Coronavirus（HCoV）科研RT-PC

Human Coronavirus（HCoV）科研RT-PCR试剂盒ELISA测定错误的原因分析：ELISA测定出现假阳性和假阴性的结果，主要有标本因素、试剂因素和操作因素，其中标本因素主要由干扰性物质所致，分内源性和外源性两种。仅供科研使用
产品名称: Human Coronavirus（HCoV）科研染料法荧光定量通用RT-PCR试剂盒
规格: 50只/套
选择方法：
1. 明确检测何种蛋白；
2. 明确编码该蛋白的基因与其它哪些物种同源性zui好； 
3. 寻找检测这些物种蛋白的试剂盒；
4. 咨询我公司使用的抗体类型；
5. 做出自己的判断该买哪个试剂盒。

动物组织匀浆的制备：
1、取组织块（0.1g～0.2g）zui少可到2～5mg在冰冷的盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中。
2、按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质（pH7.4， 0.01mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的溶液）或者0.86%的盐水于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。
3、匀浆的方式有多种：手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎。
① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成10%的匀浆液。
② 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000 转/分 上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
③ 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
4、将制备好的10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定。
对于测定结果的判定主要分定性和定量两种：
①定性测定：定性测定的结果判断一般分为"阳性"和"阴性"两种。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应，"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。
②定量测定：在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
A.测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
B.测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。
ELISA的操作要点:
1）标本的采取和保存：可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本；
2）试剂的准备：所需试剂、蒸馏水、去离子水、自配的缓冲液；
3）加样：一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
4）保温：ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育。
5）洗涤：洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。
6）显色和比色：显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。仪器准备为酶标仪。
7）结果判断：分定性判定和定量判定。
要点：
☆标本的采取和保存：可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本；
试剂的准备：所需试剂、蒸馏水、去离子水、自配的缓冲液；
加样：一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
保温：ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育。
洗涤：洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。
显色和比色：显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。仪器准备为酶标仪。
结果判断：分定性判定和定量判定。
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