pCMV-mCherry-GFP-LC3B

pCMV-mCherry-GFP-LC3B

pCMV-mCherry-GFP-LC3B是信裕生物研发的在哺乳动物细胞中表达红色mCherry和绿色GFP双标签的人源LC3B融合蛋白的质粒。该质粒含有CMV启动子，为卡那霉素抗性，转染后能够在靶细胞中高效表达带有红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP双重标签的LC3B的融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬(autophagy)的研究。本质粒转染细胞后，可以使用G418筛选稳定表达融合蛋白的细胞株。
LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3最初被分析鉴定为microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族，其中对于LC3B的研究最为广泛。到目前为止，LC3B被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程，以ATG7为E1样激活酶(E1-like activating enzyme)，以ATG3为E2样连接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共价连接上磷脂酰(phosphatidylethanolamine, PE)而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬体(autophagosome)的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬体内膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其极强的疏水性，在SDS-PAGE电泳时，LC3B II比LC3B I迁移得更快，其表观分子量分别为14kD和16kD。
自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。
自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭，这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的单体红色荧光蛋白，当其与GFP进行LC3B的共同标记时，在GFP被溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的mCherry因为其卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追踪自噬过程。
pCMV-mCherry-GFP-LC3B质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	1-602
T3 promoter and T3 primer binding site	620-639
mCherry	698-1405
GFP	1412-2125
LC3B	2138-2515
T7 promoter and T7 primer binding site	2618-2639
SV40 polyA signal	2651-3034
f1 origin of ss-DNA replication	3172-3467
bla promoter	3501-3625
SV40 promoter	3465-3983
Neomycin/kanamycin resistance ORF	4018-4809
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	4810-5268
pUC origin	5397-6064

pCMV-mCherry-GFP-LC3B质粒(6116bp)的图谱如下：

pCMV-mCherry-GFP-LC3B表达基因的详细图谱如下：

	NotI SmaI mCherry
651	GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGC CCGGGCGGAT CCAAGCTATG
	CTCGAGGTGG CGCCACCGCC GGCGAGATCG GGCCCGCCTA GGTTCGATAC
701	GTAAGCAAGG GCGAGGAGGA TAACATGGCC ATCATCAAGG AGTTCATGCG
	CATTCGTTCC CGCTCCTCCT ATTGTACCGG TAGTAGTTCC TCAAGTACGC
751	CTTCAAGGTG CACATGGAGG GCTCCGTGAA CGGCCACGAG TTCGAGATCG
	GAAGTTCCAC GTGTACCTCC CGAGGCACTT GCCGGTGCTC AAGCTCTAGC
801	AGGGCGAGGG CGAGGGCCGC CCCTACGAGG GCACCCAGAC CGCCAAGCTG
	TCCCGCTCCC GCTCCCGGCG GGGATGCTCC CGTGGGTCTG GCGGTTCGAC
851	AAGGTGACCA AGGGTGGCCC CCTGCCCTTC GCCTGGGACA TCCTGTCCCC
	TTCCACTGGT TCCCACCGGG GGACGGGAAG CGGACCCTGT AGGACAGGGG
901	TCAGTTCATG TACGGCTCCA AGGCCTACGT GAAGCACCCC GCCGACATCC
	AGTCAAGTAC ATGCCGAGGT TCCGGATGCA CTTCGTGGGG CGGCTGTAGG
951	CCGACTACTT GAAGCTGTCC TTCCCCGAGG GCTTCAAGTG GGAGCGCGTG
	GGCTGATGAA CTTCGACAGG AAGGGGCTCC CGAAGTTCAC CCTCGCGCAC
1001	ATGAACTTCG AGGACGGCGG CGTGGTGACC GTGACCCAGG ACTCCTCCCT
	TACTTGAAGC TCCTGCCGCC GCACCACTGG CACTGGGTCC TGAGGAGGGA
1051	GCAGGACGGC GAGTTCATCT ACAAGGTGAA GCTGCGCGGC ACCAACTTCC
	CGTCCTGCCG CTCAAGTAGA TGTTCCACTT CGACGCGCCG TGGTTGAAGG
1101	CCTCCGACGG CCCCGTAATG CAGAAGAAGA CCATGGGCTG GGAGGCCTCC
	GGAGGCTGCC GGGGCATTAC GTCTTCTTCT GGTACCCGAC CCTCCGGAGG
1151	TCCGAGCGGA TGTACCCCGA GGACGGCGCC CTGAAGGGCG AGATCAAGCA
	AGGCTCGCCT ACATGGGGCT CCTGCCGCGG GACTTCCCGC TCTAGTTCGT
1201	GAGGCTGAAG CTGAAGGACG GCGGCCACTA CGACGCTGAG GTCAAGACCA
	CTCCGACTTC GACTTCCTGC CGCCGGTGAT GCTGCGACTC CAGTTCTGGT
1251	CCTACAAGGC CAAGAAGCCC GTGCAGCTGC CCGGCGCCTA CAACGTCAAC
	GGATGTTCCG GTTCTTCGGG CACGTCGACG GGCCGCGGAT GTTGCAGTTG
1301	ATCAAGTTGG ACATCACCTC CCACAACGAG GACTACACCA TCGTGGAACA
	TAGTTCAACC TGTAGTGGAG GGTGTTGCTC CTGATGTGGT AGCACCTTGT
1351	GTACGAACGC GCCGAGGGCC GCCACTCCAC CGGCGGCATG GACGAGCTGT
	CATGCTTGCG CGGCTCCCGG CGGTGAGGTG GCCGCCGTAC CTGCTCGACA
	GFP
1401	ACAAGGCTAG CATGAGCAAG GGAGAAGAAC TCTTTACTGG TGTTGTCCCA
	TGTTCCGATC GTACTCGTTC CCTCTTCTTG AGAAATGACC ACAACAGGGT
1451	ATTCTGGTTG AGCTGGATGG TGATGTGAAT GGCCACAAAT TCTCTGTGTC
	TAAGACCAAC TCGACCTACC ACTACACTTA CCGGTGTTTA AGAGACACAG
1501	TGGTGAAGGT GAAGGAGATG CAACTTATGG AAAGCTGACT CTGAAGTTCA
	ACCACTTCCA CTTCCTCTAC GTTGAATACC TTTCGACTGA GACTTCAAGT
1551	TTTGTACAAC AGGAAAGCTG CCAGTGCCTT GGCCAACTCT GGTGACCACC
	AAACATGTTG TCCTTTCGAC GGTCACGGAA CCGGTTGAGA CCACTGGTGG
1601	CTGACTTATG GTGTTCAATG TTTCAGCAGG TACCCTGACC ACATGAAGCA
	GACTGAATAC CACAAGTTAC AAAGTCGTCC ATGGGACTGG TGTACTTCGT
1651	GCATGACTTC TTTAAATCTG CAATGCCAGA AGGTTATGTT CAGGAGAGGA
	CGTACTGAAG AAATTTAGAC GTTACGGTCT TCCAATACAA GTCCTCTCCT
1701	CAATCTTCTT TAAGGATGAT GGAAATTATA AGACAAGGGC AGAAGTGAAG
	GTTAGAAGAA ATTCCTACTA CCTTTAATAT TCTGTTCCCG TCTTCACTTC
1751	TTTGAAGGTG ATACACTGGT TAACAGAATT GAGCTGAAAG GCATTGATTT
	AAACTTCCAC TATGTGACCA ATTGTCTTAA CTCGACTTTC CGTAACTAAA
1801	TAAGGAAGAT GGAAACATTC TGGGTCACAA GCTGGAGTAC AACTATAATT
	ATTCCTTCTA CCTTTGTAAG ACCCAGTGTT CGACCTCATG TTGATATTAA
1851	CTCACAATGT TTACATTATG GCAGATAAGC AGAGGAATGG AATTAAGGCT
	GAGTGTTACA AATGTAATAC CGTCTATTCG TCTCCTTACC TTAATTCCGA
1901	AATTTCAAGA TTAGACACAA CATTGAGGAT GGATCTGTCC AACTGGCAGA
	TTAAAGTTCT AATCTGTGTT GTAACTCCTA CCTAGACAGG TTGACCGTCT
1951	CCATTACCAG CAGAACACCC CTATTGGTGA TGGCCCAGTT CTCCTCCCAG
	GGTAATGGTC GTCTTGTGGG GATAACCACT ACCGGGTCAA GAGGAGGGTC
2001	ATAATCACTA TCTCAGCACT CAATCTGCTC TGTCCAAAGA CCCTAATGAG
	TATTAGTGAT AGAGTCGTGA GTTAGACGAG ACAGGTTTCT GGGATTACTC
2051	AAAAGAGACC ACATGGTCCT CCTGGAGTTT GTGACAGCAG CAGGAATTAC
	TTTTCTCTGG TGTACCAGGA GGACCTCAAA CACTGTCGTC GTCCTTAATG
	LC3B
2101	TCTGGGAATG GATGAGCTGT ACAAGGGAGG TGGATCCATG CCGTCGGAGA
	AGACCCTTAC CTACTCGACA TGTTCCCTCC ACCTAGGTAC GGCAGCCTCT
2151	AGACCTTCAA GCAGCGCCGC ACCTTCGAAC AAAGAGTAGA AGATGTCCGA
	TCTGGAAGTT CGTCGCGGCG TGGAAGCTTG TTTCTCATCT TCTACAGGCT
2201	CTTATTCGAG AGCAGCATCC AACCAAAATC CCGGTGATAA TAGAACGATA
	GAATAAGCTC TCGTCGTAGG TTGGTTTTAG GGCCACTATT ATCTTGCTAT
2251	CAAGGGTGAG AAGCAGCTTC CTGTTCTGGA TAAAACAAAG TTCCTTGTAC
	GTTCCCACTC TTCGTCGAAG GACAAGACCT ATTTTGTTTC AAGGAACATG
2301	CTGACCATGT CAACATGAGT GAGCTCATCA AGATAATTAG AAGGCGCTTA
	GACTGGTACA GTTGTACTCA CTCGAGTAGT TCTATTAATC TTCCGCGAAT
2351	CAGCTCAATG CTAATCAGGC CTTCTTCCTG TTGGTGAACG GACACAGCAT
	GTCGAGTTAC GATTAGTCCG GAAGAAGGAC AACCACTTGC CTGTGTCGTA
2401	GGTCAGCGTC TCCACACCAA TCTCAGAGGT GTATGAGAGT GAGAAAGATG
	CCAGTCGCAG AGGTGTGGTT AGAGTCTCCA CATACTCTCA CTCTTTCTAC
2451	AAGATGGATT CCTGTACATG GTCTATGCCT CCCAGGAGAC GTTCGGGATG
	TTCTACCTAA GGACATGTAC CAGATACGGA GGGTCCTCTG CAAGCCCTAC
	HindIII EcoRI EcoRV SalI BglII
2501	AAATTGTCAG TGTAAAGCTT CTGCAGGAAT TCGATATCGT CGACAGATCT
	TTTAACAGTC ACATTTCGAA GACGTCCTTA AGCTATAGCA GCTGTCTAGA
	XhoI XbaI SpeI ApaI
2551	CTCGAGTCTA GAACTAGTGG GCCCGGTACC TTAATTAATT AAGGTACCAG
	GAGCTCAGAT CTTGATCACC CGGGCCATGG AATTAATTAA TTCCATGGTC

pCMV-mCherry-GFP-LC3B中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-mCherry-GFP-LC3B)包括：

AclI	AfeI	AflII	AgeI	AscI	AsiSI	BcgI
BlpI	BmgBI	BsiWI	BspEI	BspQI	BssHII	BstZ17I
EarI	EcoNI	FseI	NruI	PmeI	PmlI	PpuMI
PshAI	PspXI	SapI	ScaI	SwaI

pCMV-mCherry-GFP-LC3B中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-mCherry-GFP-LC3B once)包括：

NdeI	CA`TA,TG	240	AccI	GT`MK,AC	2540
SnaBI	TAC|GTA	346	BglII	A`GATC,T	2545
SacII	CC,GC`GG	660	PaeR7I	C`TCGA,G	2551
NotI	GC`GGCC,GC	668	XhoI	C`TCGA,G	2551
TspMI	C`CCGG,G	680	XbaI	T`CTAG,A	2557
XmaI	C`CCGG,G	680	SpeI	A`CTAG,T	2563
SmaI	CCC|GGG	682	PspOMI	G`GGCC,C	2569
SrfI	GCCC|GGGC	682	ApaI	G,GGCC`C	2569
AhdI	GACNN,N`NNGTC	891	PvuI	CG,AT`CG	2649
SbfI	CC,TGCA`GG	1049	BclI	T`GATC,A	2805
Bpu10I	CC`TNA,GC	1236	MfeI	C`AATT,G	2898
BbvCI	CC`TCA,GC	1236	BtsI	GCAGTG,NN`	2985
BsgI	GTGCAG(N)14,NN`	1290	MluI	A`CGCG,T	3034
SgrAI	CR`CCGG,YG	1379	DraIII	CAC,NNN`GTG	3261
XcmI	CCANNNN,N`NNNNTGG	1383	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	3918
XmnI	GAANN|NNTTC	2153	BspDI	AT`CG,AT	3986
HindIII	A`AGCT,T	2515	ClaI	AT`CG,AT	3986
EcoRI	G`AATT,C	2527	RsrII	CG`GWC,CG	4662
EcoRV	GAT|ATC	2535	PciI	A`CATG,T	6064
SalI	G`TCGA,C	2539

pCMV-mCherry-GFP-LC3B质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
T3 primer (620-639): 5´- AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´
T7 primer (2618-2639): 5´-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3´
pCMV-mCherry-GFP-LC3B的全序列信息请参考信裕生物网站上该质粒的信息。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
XY-2816-1μg	pCMV-mCherry-GFP-LC3B	1μg
XY-2816-100μg	pCMV-mCherry-GFP-LC3B	100μg
—	说明书	1份

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
本质粒未经信裕生物书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。