使用方法1. 如果有 N 个样品并且做定量分析,最好设置 N+7 个反应,多出的 7 个中,6 个是做标准 曲线的阳性对照,一个是阴性对照(NC)。在 N+7 个 PCR 管中,加入下列成分。如果是 做定性分析,则 6 个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照(PC),用户自己需要根据下 表进行适当修改(把 6 个标曲反应改成 1 个阳性对照反应)。 成分 N 个样品管 6 个标准 曲线管 NC 管 2×探针法 qRT-PCR 缓冲液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL 自备引物 1(10uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自备引物 2(10uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL N 个自备模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加 自备阳性对照模板(6 个梯度) 不加 各 1 uL(1 管 加 1 个梯度) 不加 阴性对照模板(水) 不加 不加 1 uL 自备探针(0.5uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自备 50×ROX I 染料 或 自备 50×ROX II 染料(见注) 各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL 5×探针法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL 补超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL 注,下列信息仅供参考,具体以 qPCR 仪器的使用手册为准。 1、不需要 ROX 的机型:Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、,、 Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型号的荧光 PCR 仪器 不需要加 ROX 染料,但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。
2、需要使用 ROX I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。