酵母质粒DNA小量提取试剂盒

酵母质粒DNA小量提取试剂盒

产品组分

货号	ZY1061 （50次）	ZY1062 （100次）	ZY1063 （200次）
RNaseA	150 μl	300 μl	600 μl
溶液YⅠ	15 ml	30 ml	60 ml
溶液YⅡ	15 ml	30 ml	60 ml
溶液YⅢ	20 ml	40 ml	80 ml
溶液PB	30 ml	50 ml	100 ml
溶液W	30 ml	30 ml×2	40 ml×3
溶液Eluent	5 ml	10 ml	20 ml
DNA纯化柱	50个	100个	200个
说明书	1份	1份	1份

 

● RNase A的浓度为10 mg/ml。

● 溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。

● 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱及蛋白变性剂，请不要直

接接触皮肤。

● 上述产品组分均可单独购买，详见产品索引。

● 本试剂盒需单独购买试剂：溶壁酶（N9031/N9032）。

产品说明

本产品采用了经典的硅胶膜及碱裂法技术，用于酵母质粒DNA小量纯化。纯化原理是用溶壁酶消化酵母细胞的细胞壁，碱裂解酵母细胞后，硅胶膜柱高效可逆地吸附体系中的质粒DNA（高盐、低pH值），蛋白及其它杂质不被吸附而被除去，被吸附的DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化。一次可从1-5 ml（不超过5×10⁷个）的过夜培养的酵母菌液中纯化高纯度质粒DNA（OD_260/280 = 1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

 

质量控制

从酵母中提取pBI121质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

 

保存条件

RNase A：可室温保存1年以上，低温可长期保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

其他试剂：室温保存。

若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

 

注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

● 溶壁酶（N9031/N9032）需要客户另行购买。

● 通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。提取的质粒DNA如用于下列实验，通常建议使用量为：

   用作PCR 模板：1-5 μl质粒DNA。

   转化大肠杆菌：5-10 μl 质粒DNA。

● 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。

● 溶液Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。

● 为了保证回收效率，请不要使用未调整pH值的超纯水洗脱目的片段。

操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1  取酵母细胞液1-5 ml（细胞数最多不超过5×10⁷）。12,000 rpm离心1min，尽量去除上清。

2  向菌体中加入300 μl溶壁酶反应缓冲液和50 U溶壁酶，涡旋振荡直至菌体完全悬浮。在摇床上220 r/min，30℃处理1 小时。

   ●  根据酵母菌株和数量的不同，所用溶壁酶用量和孵育时间应该进行适当调整。

3  5,000 rpm离心10min，去上清，收集沉淀。

4  加入250 µl溶液YⅠ/RNase A混合液，涡旋剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置1-2min。

   ●  初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液YⅠ中，均匀混合后于 4℃保存。可保存6个月。

   ●  不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

   ●  室温静置1-2 min是为使溶液中的RNA被充分降解。

5  加入250 μl溶液YⅡ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

   ●  若溶液YⅡ出现沉淀，请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现 不会影响质粒DNA的纯化结果。

   ●  不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。

   ●  此步骤不宜超过5 min。

6  加入350 μl溶液YⅢ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

7  12,000 rpm室温离心10 min，收集上清。

8  将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。

   ●  如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（700 μl），可将上清分次加 入DNA纯化柱中。

9  12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

   ●  此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。

10  加入500 μl 溶液PB，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

   ●  此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

11  加入500 μl溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

   ●  溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。

12  加入500 μl溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

13  12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

14  将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100 μl溶液Eluent，室温放置2 min。

15  12,000 rpm离心1 min， 管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20℃保存。

   ●  溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

●  对溶液Eluent 65℃预热,会提高提取质粒的产量。